इम्यूनोमोड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट (TME) दी इक मुक्ख विशेषता ऐ, पर किश अपवादें दे अलावा, उंदी पन्छान बड़ी मती ऐ । इत्थें, अस उच्च ग्रेड सीरस कार्सिनोमा (HGSC) दे मरीजें दे ट्यूमर ते जलन थमां ट्यूमर ते टी कोशिकाएं दा विश्लेषण कीता तां जे इनें बक्ख-बक्ख टीएमई डिब्बें दे मेटाबोलोम दा पता लग्गी सकै। जलोढ़ ते ट्यूमर कोशिकाएं च मेटाबोलाइट्स च व्यापक अंतर होंदा ऐ । जलन दी तुलना च ट्यूमर च घुसपैठ करने आह्ले टी कोशिकाएं च 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) च काफी समृद्धि होंदी ऐ । हालांकि टी कोशिकाएं च एमएनए दा स्तर बधी जंदा ऐ , पर निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़ (एह् एन्जाइम जेह्ड़ा एस-एडेनोसाइलमेथियोनिन थमां निकोटिनामाइड च मिथाइल समूहें दे स्थानांतरण गी उत्प्रेरक बनांदा ऐ) दी अभिव्यक्ति फाइब्रोब्लास्ट ते ट्यूमर कोशिकाएं तगर सीमित ऐ कार्यात्मक रूप कन्नै, एमएनए टी कोशिकाएं गी ट्यूमर गी बढ़ावा देने आह् ले साइटोकिन ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा गी स्रावित करने लेई प्रेरित करदा ऐ। इसलेई टीएमई-उत्पन्न एमएनए टी कोशिकाएं दे प्रतिरक्षा नियमन च योगदान दिंदा ऐ ते मनुक्खी कैंसर दे इलाज आस्तै इक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ ।
ट्यूमर थमां पैदा होने आह्ले मेटाबोलाइट्स एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा उप्पर गहरा निरोधात्मक प्रभाव पाई सकदे न , ते मते सारे सबूत दस्सदे न जे एह् रोग दे प्रगति आस्तै इक मुक्ख प्रेरणा शक्ति दे रूप च बी कम्म करी सकदे न (1) वारबर्ग प्रभाव दे अलावा, हाल दे कम्में च ट्यूमर कोशिकाएं दी चयापचय स्थिति ते ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण (टीएमई) दी प्रतिरक्षा स्थिति कन्नै इसदे रिश्तें दी विशेषता शुरू होई गेई ऐ । माउस मॉडल ते मनुक्खी टी कोशिकाएं दे अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे ग्लूटामाइन चयापचय (2), ऑक्सीडेटिव चयापचय (3) ते ग्लूकोज चयापचय (4) बक्ख-बक्ख प्रतिरक्षा कोशिकाएं दे उप-समूहें उप्पर स्वतंत्र रूप कन्नै कम्म करी सकदे न इनें रस्ते च केईं मेटाबोलाइट्स टी कोशिकाएं दे एंटी-ट्यूमर फंक्शन गी रोकदे न । एह् सिद्ध कीता गेआ ऐ जे कोएंजाइम टेट्राहाइड्रोबायोप्टेरिन (BH4) दी नाकाबंदी टी कोशिकाएं दे प्रसार गी नुकसान पजाई सकदी ऐ , ते शरीर च BH4 दी बद्धोबद्धि कन्नै सीडी 4 ते सीडी 8 दे माध्यम कन्नै एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया च वृद्धि होई सकदी ऐ इसदे अलावा, बीएच 4 (5) दे प्रशासित होने कन्नै किनुरेनिन दे इम्यूनोसप्रेसिव प्रभाव गी बचाया जाई सकदा ऐ । आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजनेज (IDH) उत्परिवर्तन ग्लियोब्लास्टोमा च एनान्टीओमेटाबोलिक (R)-2-हाइड्रोक्सीग्लूटारेट (R-2-HG) दा स्राव टी कोशिका सक्रियकरण, प्रसार ते साइटोलाइसिस गतिविधि (6) गी रोकदा ऐ। हाल च एह् दिक्खेआ गेआ ऐ जे ग्लाइकोलाइसिस दा इक उप-उत्पाद मिथाइलग्लाइओक्सल माइलोइड मूल दे सप्रेसर कोशिकाएं कन्नै पैदा होंदा ऐ ते मिथाइलग्लाइओक्सल दे टी कोशिका स्थानांतरण प्रभावत टी कोशिकाएं दे कम्मै च बाधा पाई सकदा ऐ इलाज च मिथाइलग्लाइओक्सल दा बेअसरीकरण माइलोइड-व्युत्पन्न सप्रेसर कोशिकाएं (MDSC) दी गतिविधि गी दूर करी सकदा ऐ ते माउस मॉडल च चेकपॉइंट नाकाबंदी चिकित्सा गी समन्वयात्मक रूप कन्नै बधा सकदा ऐ (7) एह् अध्ययन सामूहिक रूप कन्नै टी सेल दे कम्मै ते गतिविधि गी नियंत्रत करने च टीएमई-उत्पन्न मेटाबोलाइट्स दी मुक्ख भूमिका उप्पर जोर दिंदे न ।
अंडाशय दे कैंसर च टी सेल दी गड़बड़ी दी बड्डी जानकारी दित्ती गेई ऐ (8) । एह् आंशिक रूप कन्नै हाइपोक्सिया ते असामान्य ट्यूमर संवहनी च निहित चयापचय विशेषताएं दे कारण ऐ (9), जिसदे फलस्वरूप ग्लूकोज ते ट्रिप्टोफैन गी लैक्टिक एसिड ते किनुरेनिन जनेह् उप-उत्पादें च बदलदा ऐ अत्यधिक बाह्य कोशिका लैक्टेट इंटरफेरोन-γ (IFN-γ) दे उत्पादन गी घट्ट करदा ऐ ते माइलोसप्रेसिव उप-समूहें दे भेदभाव गी चलांदा ऐ ( 10 , 11 ) । ट्रिप्टोफैन दा सेवन सीधे तौर पर टी सेल प्रसार गी रोकदा ऐ ते टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग गी रोकदा ऐ (12-14) । इनें अवलोकनें दे बावजूद, प्रतिरक्षा चयापचय दे आसपास मता कम्म अनुकूलित मीडिया दा उपयोग करदे होई इन विट्रो टी सेल कल्चर च कीता गेआ हा, जां विवो च समरूप माउस मॉडल तगर सीमित कीता गेआ हा, जिंदे चा कोई बी मनुक्खी कैंसर ते शारीरिक मैक्रो ते माइक्रो वातावरण दी विषमता गी पूरी चाल्ली कन्नै दर्शांदा नेईं ऐ
अंडाशय दे कैंसर दी इक आम विशेषता ऐ पेरिटोनियल फैलाव ते जलन दा प्रकट होना । जलन च कोशिका तरल पदार्थ दा जमाव उन्नत रोग ते खराब पूर्वानुमान कन्नै जुड़े दा ऐ ( 15 ) । रिपोर्टें दे मुताबिक, एह् अनोखा डिब्बा हाइपोक्सिक ऐ, इस च संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) ते इंडोलिअमाइन 2,3-डाइऑक्सीजन (IDO) दा उच्च स्तर होंदा ऐ, ते टी रेगुलेटरी कोशिकाएं ते माइलोइड इंहिबिटरी कोशिकाएं (15-18) दा घुसपैठ होंदा ऐ जलन दा चयापचय वातावरण ट्यूमर दे अपने आपै च बक्ख-बक्ख होई सकदा ऐ , इस करी पेरिटोनियल स्पेस च टी कोशिकाएं दा पुनर्प्रोग्रामिंग अस्पष्ट ऐ । इसदे अलावा, ट्यूमर दे वातावरण च मौजूद जलोढ़ ते मेटाबोलाइट्स दे बश्कार मुक्ख अंतर ते विषमता प्रतिरक्षा कोशिकाएं दे घुसपैठ ते ट्यूमर उप्पर उंदे कम्मै च बाधा पाई सकदी ऐ , ते होर शोध दी लोड़ ऐ
इनें समस्याएं गी हल करने आस्तै, असें बक्ख-बक्ख कोशिकाएं दे किस्में (सीडी 4 + ते सीडी 8 + टी कोशिकाएं समेत) दे कन्नै-कन्नै ट्यूमर दे अंदर ते बिच्च बी अध्ययन करने आस्तै इक संवेदनशील कोशिका पृथक्करण ते तरल क्रोमैटोग्राफी टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) विधि डिजाइन कीती ऐ अस इस पद्धति दा उपयोग उच्च आयामी प्रवाह साइटोमेट्री ते इकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-seq) कन्नै मिलियै इनें मुक्ख आबादी दी चयापचय स्थिति दा इक उच्च रिजोल्यूशन चित्र उपलब्ध करोआने आस्तै करदे आं। इस पद्धति कन्नै ट्यूमर टी कोशिकाएं च 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) दे स्तर च मती बढ़ौतरी दिक्खी गेई, ते इन विट्रो प्रयोगें कन्नै पता चलेआ जे टी कोशिकाएं दे कम्मै पर एमएनए दा इम्यूनोमोड्यूलेटरी प्रभाव पैह्लें गै अज्ञात हा। आमतौर उप्पर एह् तरीका ट्यूमर ते प्रतिरक्षा कोशिकाएं दे बश्कार आपसी चयापचय परस्पर क्रियाएं गी उजागर करदी ऐ , ते प्रतिरक्षा नियमन चयापचय पदार्थें दे बारे च अनोखी जानकारी दिंदा ऐ , जेह्ड़ी टी कोशिका आह्ले अंडाशय दे कैंसर दे इलाज आस्तै उपयोगी होई सकदी ऐ , इलाज दे मौके
अस उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री दा इस्तेमाल इक साथ ग्लूकोज अवशोषण दी मात्रा निर्धारित करने आस्तै कीता [2- (एन-(7-नाइट्रोफिनाइल-2-ऑक्सा-1,3-डायजा-4-इल) एमिनो) -2-डिऑक्सीग्लूकोज (2-एनबीडीजी) ते माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि [माइटोट्रैकर डीप रेड (एमटी डीआर)] (7, 19, 20) बक्ख-बक्ख ठेठ न मार्कर जेह् ड़े प्रतिरक्षा कोशिकाएं ते ट्यूमर कोशिकाएं दी आबादी च भेद करदे न (तालिका S2 ते चित्र S1A) । इस विश्लेषण कन्नै पता चलेआ ऐ जे टी कोशिकाएं दी तुलना च जलोढ़ ते ट्यूमर कोशिकाएं च ग्लूकोज दे अवशोषण दा स्तर बद्ध ऐ , पर माइटोकॉन्ड्रिया दी गतिविधि च घट्ट अंतर होंदा ऐ । ट्यूमर कोशिकाएं [CD45-EpCAM (EpCAM)+] च औसत ग्लूकोज दा अवशोषण टी कोशिकाएं दे त्रै थमां चार गुना ऐ , ते सीडी 4 + टी कोशिकाएं दा औसत ग्लूकोज अवशोषण सीडी 8 + टी कोशिकाएं दे 1.2 गुना ऐ , जेह्ड़ा इस गल्लै गी दर्शांदा ऐ जे ट्यूमर घुसपैठ करने आह्ले लिम्फोसाइट्स (TIL) च इक गै TME च बी बक्ख-बक्ख चयापचय दी लोड़ होंदी ऐ (चित्र 1A) इसदे बरोबर, ट्यूमर कोशिकाएं च माइटोकॉन्ड्रिया दी गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिकाएं दे समान ऐ , ते दौनें कोशिकाएं दे किस्में दी माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिकाएं दी तुलना च मती ऐ (चित्र 1 बी) आमतौर उप्पर एह् नतीजे चयापचय दे स्तर दा पता लांदे न । ट्यूमर कोशिकाएं दी चयापचय गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिकाएं दी तुलना च मती ऐ , ते सीडी 4 + टी कोशिकाएं दी चयापचय गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिकाएं दी तुलना च मती ऐ । कोशिकाएं दे किस्में च इनें प्रभावें दे बावजूद, ट्यूमर दी तुलना च जलन च सीडी 4 + ते सीडी 8 + टी कोशिकाएं दी चयापचय स्थिति च लगातार अंतर नेईं ऐ (चित्र 1 सी) इसदे बरोबर, सीडी 45-कोशिका अंश च ट्यूमर च EpCAM+ कोशिकाएं दा अनुपात जलोढ़ दी तुलना च बधी गेआ ऐ (चित्र 1D) । असें EpCAM+ ते EpCAM- कोशिका घटकें च इक स्पष्ट चयापचय अंतर बी दिक्खेआ। EpCAM+ (ट्यूमर) कोशिकाएं च EpCAM- कोशिकाएं दी तुलना च ग्लूकोज दा अवशोषण ते माइटोकॉन्ड्रिया दी गतिविधि मती ऐ , जेह्ड़ी टीएमई च ट्यूमर कोशिकाएं च फाइब्रोब्लास्ट दी चयापचय गतिविधि थमां मती ऐ (चित्र 1, ई ते एफ)
(ए ते बी) ग्लूकोज अपटेक (2-एनबीडीजी) (ए) ते सीडी 4 + टी कोशिकाएं (MitoTracker डार्क रेड) दी माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि दी माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) (बी) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) ते सारणीबद्ध डेटा (दाएं), सीडी 8 + टी कोशिकाएं ते EpCAM + CD45-ट्यूमर कोशिकाएं थमां जलन ते ट्यूमर थमां। (C) जलन ते ट्यूमर च सीडी 4 + ते सीडी 8 + कोशिकाएं (सीडी 3 + टी कोशिकाएं दे) दा अनुपात। (D) जलन ते ट्यूमर (CD45−) च EpCAM + ट्यूमर कोशिकाएं दा अनुपात। (ई ते एफ) EpCAM + CD45-ट्यूमर ते EpCAM-CD45-मैट्रिक्स ग्लूकोज अपटेक (2-NBDG) (ई) ते माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि (MitoTracker डार्क रेड) (एफ) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) ते सारणीबद्ध डेटा ( दाएं) जलोढ़ ते ट्यूमर कोशिकाएं। (जी) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी 25, सीडी 137 ते पीडी 1 अभिव्यक्ति दे प्रतिनिधि ग्राफ। (एच ते आई) सीडी 4 + टी कोशिकाएं (एच) ते सीडी 8 + टी कोशिकाएं (आई) पर सीडी 25, सीडी 137 ते पीडी 1 अभिव्यक्ति। (जे ते के) सीसीआर7 ते सीडी 45आरओ दी अभिव्यक्ति पर आधारित भोले, केंद्रीय स्मृति (टीसीएम), प्रभावक (Teff) ते प्रभावक स्मृति (Tem) फेनोटाइप। जलन ते ट्यूमर च सीडी 4 + टी कोशिकाएं (जे) ते सीडी 8 + टी कोशिकाएं (के) दी प्रतिनिधि छवियां (बाएं) ते सारणीबद्ध आंकड़े (दाएं)। जोड़ीदार टी-परीक्षण (* पी <0.05, ** पी <0.01 ते *** पी <0.001) द्वारा निर्धारित पी मूल्य। लाइन मिलान मरीजें (n = 6) दा प्रतिनिधित्व करदी ऐ। एफएमओ, प्रतिदीप्ति माइनस इक; एमएफआई, माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता।
होर विश्लेषण च उच्च रिजोल्यूशन टी सेल फेनोटाइपिक स्थिति च होर मता अंतर दिक्खेआ गेआ। ट्यूमर च सक्रिय (चित्र 1, जी थमां मैं) ते प्रभावत स्मृति (चित्र 1, जे ते के) जलन (सीडी 3 + टी कोशिकाएं दा अनुपात) थमां मती बार होंदी ऐ । इसी तरह, सक्रियकरण मार्करें (सीडी 25 ते सीडी 137) ते डिप्लीशन मार्करें [प्रोग्रामेड सेल डेथ प्रोटीन 1 (पीडी 1)] दी अभिव्यक्ति कन्नै फेनोटाइप दा विश्लेषण करने कन्नै पता चलेआ जे हालांकि इनें आबादी दी चयापचय विशेषताएं बक्ख-बक्ख न (चित्र S1, B थमां E) , पर भोले, प्रभावक जां स्मृति उप-समूहें दे बश्कार लगातार कोई महत्वपूर्ण चयापचय अंतर नेईं दिक्खेआ गेआ (चित्र S1, F थमां I)। इनें नतीजें दी पुष्टि मशीन लर्निंग तरीकें दा इस्तेमाल करियै कोशिकाएं दे फेनोटाइपें (21) गी स्वचालित रूप कन्नै असाइन करने कन्नै कीती गेई, जिसदे कन्नै मरीज दे जलन च बड्डी संख्या च अस्थि मज्जा कोशिकाएं (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) दी मौजूदगी दा पता चलेआ (चित्र S2A) सब्भै पन्छाने गेदे कोशिकाएं दे किस्में च इस माइलोइड कोशिका आबादी च ग्लूकोज दा अवशोषण ते माइटोकॉन्ड्रिया दी गतिविधि सारें शा मती दिक्खी गेई (चित्र S2, B थमां G) । एह् नतीजे एचजीएससी दे मरीजें च जलन ते ट्यूमर च पाये जाने आह्ले मते सारे कोशिकाएं दे किस्में च मजबूत चयापचय दे अंतर गी उजागर करदे न ।
टीआईएल दी मेटाबोनोमिक विशेषताएं गी समझने च मुक्ख चुनौती ऐ जे ट्यूमर थमां पर्याप्त शुद्धता, गुणवत्ता ते मात्रा दे टी सेल दे नमूनें गी अलग करने दी लोड़ ऐ । हाल दे अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे फ्लो साइटोमेट्री दे आधार उप्पर छंटाई ते बीड समृद्धि दे तरीकें कन्नै कोशिका मेटाबोलाइट प्रोफाइल च बदलाव होई सकदा ऐ ( 22-24 ) । इस समस्या गी दूर करने आस्तै, असें एलसी-एमएस/एमएस दे विश्लेषण थमां पैह् ले शल्य चिकित्सा कन्नै रिसेक्ट कीते गेदे मनुक्खी अंडाशय कैंसर थमां टीआईएल गी अलग करने ते अलग करने आस्तै बीड संवर्धन विधि गी अनुकूलित कीता (सामग्री ते विधियां दिक्खो; चित्रा 2 ए)। मेटाबोलाइट्स च बदलाव उप्पर इस प्रोटोकॉल दे समग्र प्रभाव दा आकलन करने आस्तै असें उप्पर दित्ते गेदे बीड बक्ख-बक्ख कदम दे बाद सेह्तमंद दाताएं आसेआ सक्रिय कीते गेदे टी कोशिकाएं दे मेटाबोलाइट प्रोफाइल दी तुलना उनें कोशिकाएं कन्नै कीती जेह्ड़े बीड बक्ख नेईं कीते गेदे हे पर बर्फ उप्पर गै रेह्। इस गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण च एह् दिक्खेआ गेआ ऐ जे इनें दऊं शर्तें दे बश्कार उच्च सहसंबंध ऐ (r = 0.77), ते 86 मेटाबोलाइट्स दे समूह दी तकनीकी दोहराने दी क्षमता च उच्च दोहराने दी क्षमता ऐ (चित्र 2 बी)। इसलेई एह् तरीके कोशिकाएं दे किस्म दे संवर्धन थमां गुजरने आह्ले कोशिकाएं च सटीक मेटाबोलाइट्स विश्लेषण करी सकदे न , इस चाल्लीं एचजीएससी च विशिश्ट मेटाबोलाइट्स दी पंछान करने आस्तै पैह्ला उच्च रिजोल्यूशन मंच उपलब्ध करोआंदे न , जिस कन्नै लोकें गी कोशिका विशिश्टता दी गहरी समझ हासल करने च सक्षम बनाया जंदा ऐ लैंगिक चयापचय कार्यक्रम
(ए) चुंबकीय मनका संवर्धन दा योजनाबद्ध आरेख। एलसी-एमएस/एमएस दे विश्लेषण थमां पैह् ले, कोशिकाएं गी लगातार त्रै दौर च चुंबकीय बीड समृद्धि होग जां बर्फ पर रौह् ग। (ख) मेटाबोलाइट्स दी प्रचुरता पर समृद्धि प्रकार दा प्रभाव। हर संवर्धन प्रकार ± एसई लेई त्रै मापने दी औसत। ग्रे रेखा 1:1 रिश्ते दा प्रतिनिधित्व करदी ऐ। अक्ष लेबल च दस्सेआ गेआ बार-बार मापने दा इंट्रा-क्लास सहसंबंध (आईसीसी)। एनएडी, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लिओटाइड। (C) रोगी मेटाबोलाइट विश्लेषण दे कार्यप्रवाह दा योजनाबद्ध आरेख। जलोढ़ जां ट्यूमर मरीजें थमां इकट्ठा करियै क्रायोप्रिजर्व कीता जंदा ऐ । हर नमूने दे इक छोटे हिस्से दा विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री कन्नै कीता गेआ हा, जदके बाकी नमूनें च सीडी 4+, सीडी 8+ ते सीडी 45- कोशिकाएं आस्तै त्रै दौर समृद्धि कीते गे हे। इनें कोशिकाएं दे अंशें दा विश्लेषण एलसी-एमएस/एमएस दा उपयोग करियै कीता गेआ। (D) मानक चयापचय पदार्थ दी प्रचुरता दा गर्मी नक्शा। डेंड्रोग्राम नमूनें दे बिच्च यूक्लिडियन दूरी दे वार्ड दे क्लस्टरिंग दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। (ई) नमूने मेटाबोलाइट नक्शे दा प्रधान घटक विश्लेषण (पीसीए), हर नमूने दी त्रै प्रतिलिपिएं गी दस्सदे होई, इक गै मरीज दे नमूनें गी इक लाइन कन्नै जोड़ेआ जंदा ऐ। (F) मरीज पर कंडीशन कीते गेदे नमूने दे मेटाबोलाइट प्रोफाइल दा पीसीए (यानी आंशिक रिडंडेंसी दा उपयोग करदे होई); नमूने दा प्रकार उत्तल पतवार कन्नै सीमित ऐ । पीसी1, मुख्य घटक 1 ऐ; पीसी2, मुख्य घटक 2 ऐ।
अगले, अस इस समृद्धि पद्धति गी छह एचजीएससी मरीजें दे प्राथमिक जलन ते ट्यूमर च सीडी 4 +, सीडी 8 + ते सीडी 45-कोशिका अंशें च 99 मेटाबोलाइट्स दा विश्लेषण करने आस्तै लागू कीता (चित्र 2 सी, चित्रा S3A ते तालिका S3 ते S4)। ब्याज दी आबादी जीवित कोशिकाएं दे मूल बड्डे नमूने दा 2% थमां 70% ऐ , ते कोशिकाएं दा अनुपात मरीजें दे बश्कार मता बक्ख-बक्ख ऐ । मोती गी बक्ख करने दे बाद ब्याज दा समृद्ध अंश (सीडी 4+, सीडी 8+ जां सीडी 45-) औसतन नमूने च सब्भै जीवित कोशिकाएं दा 85% शा मता हिस्सा ऐ । एह् समृद्धि पद्धति असेंगी मनुक्खी ट्यूमर दे ऊतक दे चयापचय थमां कोशिकाएं दी आबादी दा विश्लेषण करने दी अनुमति दिंदी ऐ , जेह्ड़ा बड्डे नमूनें थमां करना असंभव ऐ । इस प्रोटोकॉल दा उपयोग करदे होई असें एह् निर्धारत कीता जे एल-काइनुरेनिन ते एडेनोसाइने, एह् दोऐ अच्छी तरह कन्नै चिन्नत इम्यूनोसप्रेसिव मेटाबोलाइट्स ट्यूमर टी कोशिकाएं जां ट्यूमर कोशिकाएं च बधी गेदे न (चित्र S3, B ते C)। इसलेई एह् नतीजे मरीज दे ऊतकें च जैविक रूप कन्नै महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स गी ढूँढने आस्तै साढ़ी कोशिका पृथक्करण ते मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक दी निष्ठा ते क्षमता गी दर्शांदे न ।
साढ़े विश्लेषण च मरीजें दे अंदर ते बिच्च कोशिकाएं दे किस्में दा इक मजबूत चयापचय बक्ख-बक्ख होने दा बी पता चलेआ (चित्र 2D ते चित्रा S4A)। खास करियै, होर मरीजें दी तुलना च, मरीज 70 ने बक्ख-बक्ख चयापचय विशेषताएं गी दस्सेआ (चित्र 2E ते चित्र S4B), जेह्दे कन्नै एह् संकेत होंदा ऐ जे मरीजें दे बश्कार काफी चयापचय विषमता होई सकदी ऐ ध्यान देने आह्ली गल्ल एह् ऐ जे होर मरीजें (1.2 थमां 2 लीटर; तालिका S1) दी तुलना च, मरीज 70 (80 मिलीलीटर) च इकट्ठे कीते गेदे जलन दी कुल मात्रा घट्ट ही । प्रधान घटक विश्लेषण दे दौरान अंतर-रोगी विषमता दा नियंत्रण (उदाहरण दे तौर पर आंशिक रिडंडेंसी विश्लेषण दा उपयोग करदे होई) कोशिकाएं दे किस्में दे बश्कार लगातार बदलाव दस्सदा ऐ , ते कोशिकाएं दे किस्म ते/जां सूक्ष्म वातावरण च मेटाबोलाइट प्रोफाइल दे अनुसार स्पष्ट रूप कन्नै इकट्ठा कीता जंदा ऐ (चित्र 2F) इकल मेटाबोलाइट्स दे विश्लेषण च इनें प्रभावें पर जोर दित्ता गेआ ते कोशिकाएं दे किस्में ते सूक्ष्म वातावरण च मता अंतर दिक्खेआ गेआ। ध्यान देने आह् ला ऐ जे सबनें शा मता अंतर दिक्खेआ गेआ ऐ जे एमएनए ऐ , जेह्ड़ा आमतौर पर सीडी 45- कोशिकाएं च ते सीडी 4+ ते सीडी 8+ कोशिकाएं च समृद्ध होंदा ऐ जेह्ड़े ट्यूमर च घुसपैठ करदे न (चित्र 3 ए) । सीडी 4 + कोशिकाएं आस्तै एह् प्रभाव सारें शा मता स्पष्ट ऐ , ते सीडी 8 + कोशिकाएं च एमएनए बी वातावरण कन्नै मता प्रभावित दिक्खेआ जंदा ऐ । लेकन एह् जरूरी नेईं ऐ , की जे छें मरीजें च सिर्फ त्रै मरीजें दा ट्यूमर सीडी 8+ स्कोर आस्तै मूल्यांकन कीता जाई सकदा ऐ । एमएनए दे अलावा, जलन ते ट्यूमर च बक्ख-बक्ख किस्म दे कोशिकाएं च, होर मेटाबोलाइट्स जेह्ड़े टीआईएल च खराब विशेषता आह्ले न, बी विभेदक रूप कन्नै समृद्ध होंदे न (चित्र S3 ते S4) । इसलेई एह् आंकड़े होर शोध लेई इम्यूनोमोड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स दा इक आशाजनक सेट उजागर करदे न।
(ए) जलन ते ट्यूमर थमां सीडी 4+, सीडी 8+ ते सीडी 45- कोशिकाएं च एमएनए दी सामान्य सामग्री। बॉक्स प्लाट च मीडियन (लाइन), इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम टिका) ते डेटा रेंज, इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम व्हिस्कर) दे 1.5 गुना तगर दस्सदा ऐ। जि’यां मरीज दी सामग्री ते विधियें च दस्सेआ गेआ ऐ, पी मान (*P<0.05 ते **P<0.01) गी निर्धारत करने आस्तै मरीज दे लिम्मा वैल्यू दा उपयोग करो। (बी) एमएनए चयापचय दा योजनाबद्ध आरेख (60)। मेटाबोलाइट्स: एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन; एसएएच, एस-एडेनोसिन-1-होमोसिस्टीन; एनए, निकोटिनामाइड; एमएनए, 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड; 2-पीवाई, 1-मिथाइल- 2-पिरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; 4-पीवाई, 1-मिथाइल-4-पिरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; एन आर, निकोटिनामाइड राइबोज; एनएमएन, निकोटिनामाइड मोनोन्यूक्लिओटाइड। एन्जाइम (हरे): एनएनएमटी, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़; SIRT, सिरतुइन्स दा; एनएएमपीटी, निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसाइल ट्रांसफरेज़; ए ओ एक्स 1, एल्डीहाइड ऑक्सीडेज 1; एनआरके, निकोटिनामाइड राइबोसाइड किनारे; एनएमएनएटी, निकोटिनामाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड एडेनिलेट ट्रांसफरेज़; Pnp1, प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज। (सी) जलन (ग्रे) ते ट्यूमर (लाल; एन = 3 मरीज) दे scRNA-seq दा टी-एसएनई। (D) scRNA-seq दा उपयोग करदे होई पन्छाने गेदे बक्ख-बक्ख कोशिका आबादी च एनएनएमटी अभिव्यक्ति। (ई) एसके-ओवी-3, मनुक्खी भ्रूण गुर्दे (एचईके) 293टी, टी कोशिकाएं ते एमएनए-इलाज टी कोशिकाएं च एनएनएमटी ते एओएक्स1 दी अभिव्यक्ति। तह कीती गेदी अभिव्यक्ति गी एसके-ओवी-3 दे सापेक्ष दस्सेआ गेआ ऐ। एसईएम कन्नै अभिव्यक्ति पैटर्न दस्सेआ गेआ ऐ (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 शा मते Ct मूल्यें गी अज्ञात (UD) मन्नेआ जंदा ऐ। (F) 8mM MNA कन्नै इलाज कीते गेदे SK-OV-3, HEK293T, टी कोशिकाएं ते टी कोशिकाएं च SLC22A1 ते SLC22A2 दी अभिव्यक्ति। तह कीती गेदी अभिव्यक्ति गी एसके-ओवी-3 दे सापेक्ष दस्सेआ गेआ ऐ। एसईएम कन्नै अभिव्यक्ति पैटर्न दस्सेआ गेआ ऐ (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 शा मते Ct मूल्यें गी अज्ञात (UD) मन्नेआ जंदा ऐ। (G) एमएनए कन्नै 72 घैंटें दे बाद सक्रिय स्वस्थ दाता टी कोशिकाएं च कोशिका एमएनए सामग्री। एसईएम कन्नै अभिव्यक्ति पैटर्न दस्सेआ गेआ ऐ (n = 4 स्वस्थ दाता)।
एमएनए निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़ (एनएनएमटी; चित्रा 3 बी) द्वारा एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन (एसएएम) थमां निकोटिनामाइड (एनए) च मिथाइल समूह गी स्थानांतरित करियै पैदा कीता जंदा ऐ। एनएनएमटी मनुक्खी कैंसर दे किस्म-किस्म च मती मात्रा च अभिव्यक्त होंदा ऐ ते प्रसार, आक्रमण ते मेटास्टेसिस कन्नै जुड़े दा ऐ (25-27) । टीएमई च टी कोशिकाएं च एमएनए दे स्रोत गी बेहतर तरीके कन्नै समझने आस्तै, असें त्रै एचजीएससी मरीजें दे जलन ते ट्यूमर च कोशिकाएं दे किस्में च एनएनएमटी दी अभिव्यक्ति दी विशेषता आस्तै scRNA-seq दा इस्तेमाल कीता (तालिका S5)। लगभग 6,500 कोशिकाएं दे विश्लेषण कन्नै पता चलेआ ऐ जे जलन ते ट्यूमर दे वातावरण च एनएनएमटी अभिव्यक्ति अनुमानित फाइब्रोब्लास्ट ते ट्यूमर कोशिकाएं दी आबादी तगर सीमित ही (चित्र 3, सी ते डी) । ध्यान देने आह् ला ऐ जे कुसै बी आबादी च एनएनएमटी दी कोई स्पष्ट अभिव्यक्ति नेईं ऐ जेह् ड़ी पीटीपीआरसी (सीडी 45 +) गी एक्सप्रेस करदी ऐ (चित्र 3 डी ते चित्रा S5A), जेह् ड़ी इस गल्लै गी दस्सा करदी ऐ जे मेटाबोलाइट स्पेक्ट्रम च पता लाए गेदे एमएनए गी टी कोशिकाएं च पेश कीता गेआ ऐ एल्डीहाइड ऑक्सीडेज 1 (AOX1) दी अभिव्यक्ति एमएनए गी 1-मिथाइल-2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-PYR) जां 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4- PYR) च बदलदी ऐ; चित्र 3 बी) COL1A1 (चित्र S5A) गी एक्सप्रेस करने आह् ले फाइब्रोब्लास्ट दी आबादी तगर बी सीमित ऐ, जेह् ड़े इकट्ठे होईये इस गल्लै गी दर्शांदे न जे टी कोशिकाएं च परंपरागत एमएनए चयापचय दी क्षमता दी कमी ऐ । इनें एमएनए-सम्बंधी जीन दे अभिव्यक्ति पैटर्न गी एचजीएससी मरीजें थमां जलन थमां इक दुए स्वतंत्र कोशिका डेटा सेट दा उपयोग करियै सत्यापन कीता गेआ (चित्र S5B; n = 6) (16)। इसदे अलावा, एमएनए कन्नै इलाज कीते गेदे स्वस्थ दाता टी कोशिकाएं दे मात्रात्मक पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) विश्लेषण कन्नै पता चलेआ ऐ जे नियंत्रण एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिकाएं दी तुलना च एनएनएमटी जां एओएक्स1 लगभग व्यक्त नेईं कीता गेआ ऐ (चित्र 3 ई) एह् अप्रत्याशित नतीजे इस गल्लै गी दस्सनदे न जे एमएनए फाइब्रोब्लास्ट जां ट्यूमर थमां टीएमई च बक्ख-बक्ख टी कोशिकाएं च स्रावित होई सकदा ऐ ।
हालांकि उम्मीदवारें च घुलनशील वाहक 22 (SLC22) परिवार (SLC22A1, SLC22A2 ते SLC22A3) आसेआ एन्कोड कीते गेदे कार्बनिक कैटशियम ट्रांसपोर्टर 1 थमां 3 (OCT1, OCT2 ते OCT3) दा परिवार शामल ऐ, पर एमएनए दे संभावित ट्रांसपोर्टर अजें बी अपरिभाषित न (28) स्वस्थ दाता टी कोशिकाएं थमां mRNA दे QPCR ने SLC22A1 दे कम अभिव्यक्ति स्तर पर SLC22A2 दे अज्ञात स्तर गी दस्सेआ, जिस कन्नै इस गल्लै दी पुष्टि होई जे एह् पैह्लें साहित्य च रिपोर्ट कीती गेई ही (चित्र 3F) (29)। इसदे बरोबर, एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिका लाइन ने दौनें ट्रांसपोर्टरें दे उच्च स्तर गी व्यक्त कीता (चित्र 3 एफ)।
टी कोशिकाएं च विदेशी एमएनए गी सोखने दी समर्थता दी संभावना गी परखने आस्तै, सेह्तमंद दाता टी कोशिकाएं गी एमएनए दी बक्ख-बक्ख सांद्रता दी मौजूदगी च 72 घैंटें तगर संस्कार कीता गेआ। बहिर्जात एमएनए दी गैर मौजूदगी च एमएनए दी कोशिका सामग्री दा पता नेईं लग्गी सकदा (चित्र 3 जी) । हालांकि, बहिर्जात एमएनए कन्नै इलाज कीते गेदे सक्रिय टी कोशिकाएं च कोशिकाएं च एमएनए दी मात्रा च खुराक-निर्भर वृद्धि दिक्खी गेई, जेह्ड़ी 6 मिमी एमएनए तगर (चित्र 3 जी) । एह् नतीजा दस्सदा ऐ जे ट्रांसपोर्टर एक्सप्रेशन दे घट्ट स्तर ते इंट्रासेलुलर एमएनए चयापचय आस्तै जिम्मेदार मुक्ख एन्जाइम दी कमी दे बावजूद बी टीआईएल एमएनए गी लेई सकदा ऐ ।
मरीजें दे टी कोशिकाएं च मेटाबोलाइट्स दे स्पेक्ट्रम ते इन विट्रो एमएनए अवशोषण प्रयोगें कन्नै इस संभावना गी बधाया जंदा ऐ जे कैंसर कन्नै सरबंधत फाइब्रोब्लास्ट (CAF) एमएनए गी स्रावित करदे न ते ट्यूमर कोशिकाएं टीआईएल दे फेनोटाइप ते कार्य-प्रणाली गी नियंत्रत करी सकदियां न टी कोशिकाएं पर एमएनए दे प्रभाव गी निर्धारत करने आस्तै एमएनए दी मौजूदगी जां अनुपस्थिति च सेह्तमंद दाता टी कोशिकाएं गी विट्रो च सक्रिय कीता गेआ हा , ते उंदे प्रसार ते साइटोकिन उत्पादन दा मूल्यांकन कीता गेआ हा । 7 दिनें दे बाद एमएनए गी उच्चतम खुराक च जोड़ने दे बाद जनसंख्या दोगुना होने दी संख्या च मध्यम कमी आई ऐ , जदके सब्भै खुराक च जोश बनाई रक्खी गेई ही (चित्र 4 ए) । इसदे अलावा, बहिर्जात एमएनए दे इलाज दे नतीजे च ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (TNFα; चित्रा 4 बी) गी एक्सप्रेस करने आह्ले सीडी 4 + ते सीडी 8 + टी कोशिकाएं दे अनुपात च वृद्धि होंदी ऐ । इसदे बरोबर, IFN-γ दे अंतःकोशिकीय उत्पादन च सीडी 4 + टी कोशिकाएं च काफी कमी आई ऐ , पर सीडी 8 + टी कोशिकाएं च नेईं , ते इंटरल्यूकिन 2 (आईएल-2; चित्रा 4, सी ते डी) च कोई खास बदलाव नेईं दिक्खेआ गेआ। इसलेई इनें एमएनए-इलाज टी सेल संस्कृतियें थमां सुपरनेटेंटें दे एन्जाइम-लिंक इम्यूनोसॉर्बेंट परीक्षण (ELISA) च TNFα च मती बढ़ौतरी, IFN-γ च कमी, ते आईएल-2 च कोई बदलाव नेईं दिक्खेआ गेआ (चित्र 4, ई थमां जी)। . IFN-γ दी कमी इस गल्लै गी दर्शांदी ऐ जे एमएनए टी कोशिकाएं दी एंटी-ट्यूमर गतिविधि गी रोकने च भूमिका निभा सकदा ऐ । टी सेल-मध्यस्थ साइटोटोक्सिसिटी पर एमएनए दे प्रभाव दा अनुकरण करने आस्तै, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -CAR-T) कोशिकाएं कन्नै नियंत्रित फोलेट रिसेप्टर α ते CAR-T (GFP) गी लक्ष्य करियै काइमेरियल एंटीजन रिसेप्टर टी (FRα-CAR-T) कोशिकाएं गी स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (PBMC) आसेआ पैदा कीता जंदा ऐ सीएआर-टी कोशिकाएं गी एमएनए दी मौजूदगी च 24 घैंटें तगर संस्कार कीता गेआ हा, ते उसदे बाद मनुक्खी एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिकाएं कन्नै 10:1 दे प्रभावत ते लक्ष्य अनुपात च फोलेट रिसेप्टर α गी एक्सप्रेस करने आह्ले कन्नै सह-संवर्धित कीता गेआ हा। एमएनए दे इलाज दे नतीजे च FRα-CAR-T कोशिकाएं दी मारने दी गतिविधि च काफी कमी आई ऐ, जेह्ड़ी एडेनोसाइने कन्नै इलाज कीते गेदे FRα-CAR-T कोशिकाएं दे समान ही (चित्र 4H) ।
(ए) कुल व्यवहार्य कोशिका गिनती ते जनसंख्या दोगुना (पीडी) 7 दिनें च संस्कार थमां सीधे तौर पर बार ग्राफ छह स्वस्थ दाताएं दे औसत + एसईएम दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ । कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगें दे डेटा दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। (बी थमां डी) सीडी 3/सीडी 28 ते आईएल-2 दा इस्तेमाल 7 दिनें तगर अपनी-अपनी एमएनए सांद्रता च टी कोशिकाएं गी सक्रिय करने आस्तै कीता गेआ। विश्लेषण थमां पैह् ले कोशिकाएं गी गोल्गीस्टॉप कन्नै पीएमए/आयनोमाइसिन कन्नै 4 घैंटें तगर उत्तेजित कीता गेआ। टी कोशिकाएं च TNFα (बी) अभिव्यक्ति। जीवित कोशिकाएं च TNFα अभिव्यक्ति दी उदाहरण छवि (बाएं) ते सारणीबद्ध डेटा (दाएं)। टी कोशिकाएं च आईएफएन-γ (सी) ते आईएल-2 (डी) अभिव्यक्ति। साइटोकिनें दी अभिव्यक्ति गी फ्लो साइटोमेट्री कन्नै मापा गेआ। बार ग्राफ औसत (n = 6 स्वस्थ दाता) + एसईएम दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। पी मूल्य निर्धारत करने लेई विचरण ते बार-बार मापने (*P<0.05 ते **P<0.01) दा इक-तरफा विश्लेषण दा उपयोग करो। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगें दे डेटा दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। (ई थमां जी) सीडी 3/सीडी 28 ते आईएल-2 दा इस्तेमाल 7 दिनें तगर अपनी-अपनी एमएनए सांद्रता च टी कोशिकाएं गी सक्रिय करने आस्तै कीता गेआ। पीएमए/आयनोमाइसिन उत्तेजना दे 4 घैंटें शा पैह्ले ते बाद च माध्यम इकट्ठा कीता गेआ। TNFα (E), IFN-γ (F) ते IL-2 (G) दी सांद्रता गी एलिसा द्वारा मापा गेआ। बार ग्राफ औसत (n = 5 स्वस्थ दाता) + एसईएम दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। विचरण ते बार-बार मापने दे इक तरफा विश्लेषण दा उपयोग करदे होई निर्धारत पी मूल्य (* पी <0.05)। बिंदीदार रेखा पता लाने दी सीमा गी दर्शांदी ऐ। (एच) कोशिका लाइसिस परख। FRα-CAR-T जां GFP-CAR-T कोशिकाएं गी 24 घैंटें तगर एडेनोसाइने (250μM) जां MNA (10 mM) कन्नै समायोजित कीता गेआ हा, जां बिना इलाज दे (Ctrl) छोड़ी दित्ता गेआ हा। एसके-ओवी-3 कोशिकाएं दी प्रतिशत हत्या गी मापा गेआ। वेल्च टी परीक्षण (* पी <0.5 ते ** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान।
एमएनए-निर्भर TNFα अभिव्यक्ति नियमन दी यंत्रवत समझ हासल करने आस्तै, एमएनए-इलाज कीते गेदे टी कोशिकाएं दे TNFα mRNA च बदलाव दा मूल्यांकन कीता गेआ (चित्र 5 ए)। एमएनए कन्नै इलाज कीते गेदे सेह्तमंद दाता टी कोशिकाएं च TNFα ट्रांसक्रप्शन दे स्तर च दो गुना बद्धोबद्धी दिक्खी गेई ऐ , जेह्ड़ी इस गल्लै गी दस्सा करदी ऐ जे एमएनए TNFα ट्रांसक्रप्शन नियमन उप्पर निर्भर ऐ । इस संभावित नियामक तंत्र दी जांच करने आस्तै, दो ज्ञात ट्रांसक्रप्शन कारक जेह् ड़े TNFα गी नियंत्रत करदे न, अर्थात सक्रिय टी सेल न्यूक्लियर कारक (NFAT) ते विशिष्ट प्रोटीन 1 (Sp1), प्रोक्सिमल TNFα प्रवर्तक ( 30 ) कन्नै एमएनए बंड दे जवाब च मूल्यांकन कीता गेआ। TNFα प्रोमोटर च 6 पन्छाने गेदे NFAT बद्धोबद्ध साइट ते 2 Sp1 बद्धोबद्ध साइट होंदे न, जेह्ड़े इक साइट पर ओवरलैप होंदे न [5’cap थमां -55 बेस जोड़े (bp)] (30) । क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसिपिटेशन (ChIP) ने दस्सेआ जे एमएनए कन्नै इलाज करने पर TNFα प्रोमोटर कन्नै Sp1 दा बंड त्रै गुना बधी जंदा ऐ। एनएफएटी दे शामल होने च बी बद्धोबद्ध होआ ते महत्व दे नेड़ै आई गेआ (चित्र 5 बी)। एह् आंकड़े दस्सदे न जे एमएनए Sp1 ट्रांसक्रप्शन दे माध्यम कन्नै TNFα दी अभिव्यक्ति गी नियंत्रत करदा ऐ , ते घट्ट हद तकर NFAT दी अभिव्यक्ति गी नियंत्रत करदा ऐ ।
(ए) एमएनए दे बगैर संस्कारित टी कोशिकाएं कन्नै तुलना च, एमएनए कन्नै इलाज कीते गेदे टी कोशिकाएं च TNFα अभिव्यक्ति च गुना बदलाव। एसईएम कन्नै अभिव्यक्ति पैटर्न दस्सेआ गेआ ऐ (n = 5 स्वस्थ दाता)। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगें दे डेटा दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। (B) NFAT ते Sp1 दे बाद 8 mM MNA कन्नै जां बगैरा कन्नै इलाज कीते गेदे टी कोशिकाएं दे TNFα प्रोमोटर गी 4 घैंटें तगर (Ctrl) ते PMA/ionomycin उत्तेजना कन्नै जोड़ेआ गेआ। इम्यूनोग्लोबुलिन जी (IgG) ते H3 गी क्रमशः नकारात्मक ते सकारात्मक नियंत्रण दे रूप च इस्तेमाल कीता गेआ। चिप दी मात्रा निर्धारण च दस्सेआ गेआ ऐ जे एमएनए-इलाज कीते गेदे कोशिकाएं च TNFα प्रोमोटर कन्नै Sp1 ते NFAT दे बंड च नियंत्रण दी तुलना च केईं गुना बद्धोबद्ध होआ ऐ । कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगें दे डेटा दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। कई टी-परीक्षण (*** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान। (C) एचजीएससी दे जलोढ़ दी तुलना च टी कोशिकाएं (गैर-साइटोटोक्सिक) च ट्यूमर च टीएनएफ दी अभिव्यक्ति च वृद्धि दिक्खी गेई। रंग बक्ख-बक्ख मरीजें दा प्रतिनिधित्व करदे न। प्रदर्शत कोशिकाएं गी बेतरतीब ढंगै कन्नै 300 तगर नमूना लैता गेआ ऐ ते ओवरड्राइंग गी सीमित करने आस्तै जिटर कीता गेआ ऐ (** Padj = 0.0076)। (D) अंडाशय कैंसर आस्तै एमएनए दा प्रस्तावित मॉडल। एमएनए टीएमई च ट्यूमर कोशिकाएं ते फाइब्रोब्लास्ट च पैदा होंदा ऐ ते टी कोशिकाएं आसेआ लैता जंदा ऐ । एमएनए TNFα प्रोमोटर कन्नै Sp1 दे बंड गी बधांदा ऐ, जिस कन्नै TNFα ट्रांसक्रप्शन ते TNFα साइटोकिन उत्पादन च वृद्धि होंदी ऐ। एमएनए कन्नै बी आईएफएन-γ च कमी औंदी ऐ । टी सेल दे कम्मै च रोकथाम कन्नै मारने दी क्षमता च कमी ते ट्यूमर दी वृद्धि च तेजी औंदी ऐ ।
रिपोर्टें दे मुताबिक, TNFα दे सामने ते पिच्छें-निर्भर एंटी-ट्यूमर ते एंटी-ट्यूमर प्रभाव होंदे न, पर एह्दे कन्नै अंडाशय दे कैंसर दे विकास ते मेटास्टेसिस गी बढ़ावा देने च मती मशहूर भूमिका ऐ ( 31-33 ) । रिपोर्टें दे अनुसार अंडाशय दे कैंसर दे मरीजें च जलन ते ट्यूमर दे ऊतकें च TNFα दी सांद्रता सौम्य ऊतकें च मती ऐ ( 34-36 ) । तंत्र दे मामले च, TNFα सफेद खून दी कोशिकाएं दी सक्रियता, कार्य-प्रणाली ते प्रसार गी नियंत्रत करी सकदा ऐ, ते कैंसर कोशिकाएं दे फेनोटाइप गी बदली सकदा ऐ (37, 38) । इनें निष्कर्षें दे अनुरूप, विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण ने दस्सेआ जे ट्यूमर दे ऊतकें च टी कोशिकाएं च जलोढ़ दी तुलना च टीएनएफ काफी हद तकर अप-रेगुलेट होंदा ऐ (चित्र 5 सी) । TNF अभिव्यक्ति च वृद्धि सिर्फ गैर-साइटोटोक्सिक फेनोटाइप कन्नै टी कोशिका आबादी च गै दिक्खी गेई (चित्र S5A)। संक्षेप च, एह् आंकड़े इस विचार दा समर्थन करदे न जे एमएनए च एचजीएससी च दोहरी इम्यूनोसप्रेसिव ते ट्यूमर गी बढ़ावा देने आह्ले प्रभाव होंदे न ।
फ्लो साइटोमेट्री दे आधार उप्पर फ्लोरोसेंट लेबलिंग टीआईएल चयापचय दे अध्ययन आस्तै मुक्ख तरीका बनी गेई ऐ । इनें अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स जां सेकेंडरी लिम्फोइड अंगें थमां टी कोशिकाएं दी तुलना च मूरीन ते मनुक्खी टीआईएल च ग्लूकोज गी अपनाने दी प्रवृत्ति मती ऐ ( 4 , 39 ) ते माइटोकॉन्ड्रिया दे कम्मै च धीरे-धीरे नुकसान होंदा ऐ ( 19 , 40 ) हालांकि इस अध्ययन च असें गी इसी जनेह् नतीजे दिक्खे न, पर मुक्ख विकास इक गै रिसेक्टेड ट्यूमर ऊतक थमां ट्यूमर कोशिकाएं ते टीआईएल दे चयापचय दी तुलना करना ऐ । इनें पिछली रिपोर्टें च किश दे अनुरूप, जलोढ़ ते ट्यूमर थमां ट्यूमर (CD45-EpCAM +) कोशिकाएं च सीडी 8 + ते सीडी 4 + टी कोशिकाएं दी तुलना च ग्लूकोज दा अवशोषण मता ऐ , जेह्ड़ा इस गल्लै दा समर्थन करदा ऐ जे ट्यूमर कोशिकाएं दे उच्च ग्लूकोज अवशोषण दी तुलना टी कोशिकाएं कन्नै कीती जाई सकदी ऐ टी सेल प्रतिस्पर्धा दी अवधारणा। टीएमई। लेकन ट्यूमर कोशिकाएं दी माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिकाएं दी तुलना च मती ऐ , पर माइटोकॉन्ड्रिया दी गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिकाएं दे समान ऐ । एह् नतीजे इस उभरदे विशे गी मजबूत करदे न जे आक्सीडेटिव मेटाबॉलिज्म ट्यूमर कोशिकाएं आस्तै महत्वपूर्ण ऐ ( 41 , 42 ) । एह् बी सुझाऽ दिंदे न जे सीडी 8 + टी कोशिकाएं सीडी 4 + टी कोशिकाएं दी तुलना च ऑक्सीडेटिव डिसफंक्शन आस्तै मती संवेदनशील होई सकदियां न , जां सीडी 4 + टी कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रिया दी गतिविधि गी बनाए रखने आस्तै ग्लूकोज दे अलावा कार्बन स्रोतें दा इस्तेमाल करी सकदियां न ( 43 , 44 ) एह् दिक्खेआ जा जे जलोढ़ च सीडी 4 + टी इफेक्टरें, टी इफेक्टर मेमोरी ते टी सेंट्रल मेमोरी कोशिकाएं च ग्लूकोज दे अवशोषण जां माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि च कोई फर्क नेईं दिक्खेआ गेआ। इसी गै, ट्यूमर च सीडी 8 + टी कोशिकाएं दी भेदभाव दी स्थिति दा ग्लूकोज दे अवशोषण च बदलाव कन्नै कोई लेना-देना नेईं ऐ , जेह्ड़ा विट्रो च संस्कारित टी कोशिकाएं ते विवो च मनुक्खी टीआईएल दे बश्कार मता अंतर गी उजागर करदा ऐ ( 22 ) इनें अवलोकनें दी पुष्टि निष्पक्ष स्वचालित कोशिका आबादी आबंटन दे इस्तेमाल कन्नै बी कीती गेई ऐ , जेह्दे कन्नै होर पता चलेआ ऐ जे ट्यूमर कोशिकाएं दी तुलना च उच्च ग्लूकोज अवशोषण ते माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि आह्ले सीडी 45 + / सीडी 3- / सीडी 4 + / सीडी 45आरओ + कोशिकाएं च प्रचलित ऐ पर मेटाबोलिक सक्रिय कोशिका आबादी ऐ एह् आबादी scRNA-seq विश्लेषण च चिह्नित माइलोइड सप्रेसर कोशिकाएं जां प्लाज्मासाइटोइड डेंड्राइटिक कोशिकाएं दी कथित उप-जनसंख्या दा प्रतिनिधित्व करी सकदी ऐ । हालांकि एह् दवैं मनुक्खी अंडाशय ट्यूमर च दिक्खे गे न [45] , पर अजें बी इस माइलोइड उप-जनसंख्या दा वर्णन करने आस्तै होर कम्म करने दी लोड़ ऐ ।
हालांकि फ्लो साइटोमेट्री आह्ले तरीकें कन्नै कोशिकाएं दे किस्में दे बश्कार ग्लूकोज ते ऑक्सीडेटिव चयापचय च सामान्य अंतर गी स्पश्ट कीता जाई सकदा ऐ , पर टीएमई च माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय आस्तै ग्लूकोज जां होर कार्बन स्रोतें आसेआ पैदा कीते गेदे सटीक मेटाबोलाइट्स अजें तगर निर्धारत नेईं कीते गे न दित्ते गेदे टीआईएल उप-समूह च मेटाबोलाइट्स दी मौजूदगी जां अनुपस्थिति गी असाइन करने आस्तै कोशिका आबादी गी एक्साइज कीते गेदे ऊतक थमां शुद्ध करने दी लोड़ होंदी ऐ । इसलेई मास स्पेक्ट्रोमेट्री कन्नै मिलियै साढ़ी कोशिका समृद्धि पद्धति कन्नै मरीज दे नमूनें दे मिलान च टी कोशिकाएं ते ट्यूमर कोशिकाएं दी आबादी च अंतरात्मक रूप कन्नै समृद्ध होने आह्ले मेटाबोलाइट्स दे बारे च जानकारी दित्ती जाई सकदी ऐ हालांकि इस पद्धति कन्नै फ्लोरोसेंस-सक्रिय कोशिका छंटाई दे मुकाबले फायदे न, पर किश मेटाबोलाइट्स लाइब्रेरी निहित स्थिरता ते/जां तेजी कन्नै टर्नओवर दर दे कारण प्रभावित होई सकदियां न (22) । इसदे बावजूद, साढ़ा तरीका दो मान्यता प्राप्त इम्यूनोसप्रेसिव मेटाबोलाइट्स, एडेनोसाइने ते किनुरेनिन दी पन्छान करने च सक्षम हा, कीजे एह् नमूनें दे किस्में च मता बक्ख-बक्ख न।
ट्यूमर ते टीआईएल उप-प्रकारें दा साढ़ा मेटाबोनोमिक विश्लेषण अंडाशय टीएमई च मेटाबोलाइट्स दी भूमिका दे बारे च होर जानकारी दिंदा ऐ। पैह् ला, फ्लो साइटोमेट्री दा उपयोग करियै असें एह् निर्धारत कीता जे ट्यूमर ते सीडी 4 + टी कोशिकाएं दे बिच्च माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि च कोई फर्क नेईं ऐ । लेकन एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण च इनें आबादी च मेटाबोलाइट्स दी प्रचुरता च मता बदलाव दिक्खेआ गेआ ऐ, जेह्ड़ा इस गल्लै गी दस्सा करदा ऐ जे टीआईएल चयापचय ते इसदी समग्र चयापचय गतिविधि दे बारे च निष्कर्षें गी सावधानी कन्नै व्याख्या करने दी लोड़ ऐ दूआ, एमएनए ट्यूमर च नेईं, जलन च सीडी 45-कोशिकाएं ते टी कोशिकाएं च सारें शा मता अंतर आह्ला मेटाबोलाइट ऐ । इसलेई डिब्बे च बंड ते ट्यूमर दे स्थान दे टीआईएल चयापचय पर बक्ख-बक्ख प्रभाव होंदे न , जेह्ड़ा दित्ते गेदे सूक्ष्म वातावरण च संभावित विषमता गी उजागर करदा ऐ । तीसरी गल्ल, एमएनए पैदा करने आह् ले एन्जाइम एनएनएमटी दी अभिव्यक्ति मुख्य रूप कन्नै सीएएफ तगर सीमित ऐ, जेह् ड़ी घट्ट हद तकर ट्यूमर कोशिकाएं च ऐ, पर ट्यूमर थमां पैदा होने आह् ले टी कोशिकाएं च पता लाने आह् ले एमएनए दे स्तर दिक्खे जंदे न। अंडाशय सीएएफ च एनएनएमटी दी अत्यधिक अभिव्यक्ति दा कैंसर गी बढ़ावा देने आह्ला इक ज्ञात प्रभाव होंदा ऐ , जेह्ड़ा किश हद तकर सीएएफ चयापचय, ट्यूमर आक्रमण ते मेटास्टेसिस दे बढ़ावा दे कारण होंदा ऐ ( 27 ) । हालांकि टीआईएल दा समग्र स्तर मध्यम ऐ , पर सीएएफ च एनएनएमटी दी अभिव्यक्ति कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) मेसेंकिमल उप-प्रकार कन्नै नेड़में कन्नै जुड़ी दी ऐ , जेह्ड़ी खराब पूर्वानुमान कन्नै जुड़ी दी ऐ ( 27 , 46 , 47 ) आखरी च, एमएनए दे क्षय आस्तै जिम्मेदार एन्जाइम AOX1 दी अभिव्यक्ति बी सीएएफ आबादी तगर सीमित ऐ, जेह्ड़ी इस गल्लै गी दस्सा करदी ऐ जे टी कोशिकाएं च एमएनए च चयापचय करने दी क्षमता दी कमी ऐ । एह् नतीजे इस विचार दा समर्थन करदे न जे हालांकि इस खोज दी सत्यापन आस्तै होर कम्म करने दी लोड़ ऐ , पर टी कोशिकाएं च एमएनए दा उच्च स्तर इम्यूनोसप्रेसिव सीएएफ सूक्ष्म वातावरण दी मौजूदगी दा संकेत देई सकदा ऐ ।
एमएनए ट्रांसपोर्टरें दे घट्ट अभिव्यक्ति स्तर ते एमएनए चयापचय च शामल मुक्ख प्रोटीन दे अज्ञात स्तर गी दिक्खदे होई टी कोशिकाएं च एमएनए दी मौजूदगी अप्रत्याशित ऐ । दो स्वतंत्र कोहर्टें दे scRNA-seq विश्लेषण ते लक्ष्यित qPCR कन्नै न ते एनएनएमटी ते न गै एओएक्स1 दा पता लाया जाई सकेआ। एह् नतीजे इस गल्लै गी दस्सनदे न जे एमएनए टी कोशिकाएं आसेआ संश्लेषित नेईं होंदा ऐ , बल्के आसपास दे टीएमई थमां अवशोषित होंदा ऐ । इन विट्रो प्रयोगें कन्नै पता चलेआ ऐ जे टी कोशिकाएं च बहिर्जात एमएनए इकट्ठा करने दी प्रवृत्ति होंदी ऐ ।
साढ़े इन विट्रो अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे बहिर्जात एमएनए टी कोशिकाएं च TNFα दी अभिव्यक्ति गी प्रेरित करदा ऐ ते TNFα प्रवर्तक कन्नै Sp1 दे बंड गी बधांदा ऐ । हालांकि TNFα दे एंटी-ट्यूमर ते एंटी-ट्यूमर दोनों कार्य होंदे न, पर अंडाशय दे कैंसर च TNFα अंडाशय दे कैंसर दी वृद्धि गी बढ़ावा देई सकदा ऐ (31-33) । अंडाशय ट्यूमर कोशिका संस्कार च TNFα दा बेअसर करना जां माउस मॉडल च TNFα संकेत गी खत्म करना TNFα-मध्यस्थ भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन च सुधार ते ट्यूमर दी वृद्धि गी रोक सकदा ऐ ( 32 , 35 ) इसलेई इस मामले च टीएमई-उत्पन्न एमएनए आटोक्राइन लूप दे माध्यम कन्नै टीएनएफα-निर्भर तंत्र दे माध्यम कन्नै प्रो-इंफ्लेमेटरी मेटाबोलाइट दे रूप च कम्म करी सकदा ऐ, जिस कन्नै अंडाशय दे कैंसर दी घटना ते फैलाव गी बढ़ावा दित्ता जंदा ऐ ( 31 ) इस संभावना दे आधार उप्पर, TNFα नाकाबंदी दा अध्ययन अंडाशय दे कैंसर आस्तै इक संभावित चिकित्सकीय एजेंट दे रूप च कीता जा करदा ऐ (37, 48, 49) । इसदे अलावा, एमएनए अंडाशय ट्यूमर कोशिकाएं च सीएआर-टी कोशिकाएं दी साइटोटोक्सिसिटिस गी बिगाड़दा ऐ, जेह्दे कन्नै एमएनए-मध्यस्थ प्रतिरक्षा दमन आस्तै होर सबूत उपलब्ध होंदे न । सामूहिक रूप कन्नै, एह् नतीजे इक माडल दा सुझाऽ दिंदे न जिस च ट्यूमर ते सीएएफ कोशिकाएं एमएनए गी बहिष्कार टीएमई च स्रावित करदे न । (i) TNF-प्रेरित अंडाशय कैंसर दी वृद्धि उत्तेजना ते (ii) MNA-प्रेरित टी सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि निरोध दे माध्यम कन्नै, इसदा दोहरी ट्यूमर प्रभाव होंदा ऐ (चित्र 5D) ।
निष्कर्ष च, तेजी कन्नै कोशिका समृद्धि, इक कोशिका अनुक्रमण ते चयापचय प्रोफाइलिंग दे संयोजन गी लागू करियै, इस अध्ययन च एचजीएससी दे मरीजें च ट्यूमर ते जलोढ़ कोशिकाएं दे बश्कार बड्डे पैमाने पर इम्यूनोमेटाबोलोमिक अंतर दा पता चलेआ। इस व्यापक विश्लेषण कन्नै पता चलेआ जे टी कोशिकाएं दे बिच्च ग्लूकोज दे अवशोषण ते माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि च अंतर ऐ , ते एमएनए गी गैर-कोशिका स्वायत्त प्रतिरक्षा नियंत्रक चयापचय दे रूप च पन्छानेआ गेआ ऐ । इनें आंकड़ें दा असर इस गल्लै उप्पर पौंदा ऐ जे टीएमई मनुक्खी कैंसर च टी सेल मेटाबॉलिज्म गी किस चाल्लीं प्रभावित करदा ऐ । हालांकि टी कोशिकाएं ते कैंसर कोशिकाएं दे बश्कार पोशक तत्वें आस्तै सीधी प्रतिस्पर्धा दी जानकारी दित्ती गेई ऐ , पर मेटाबोलाइट्स ट्यूमर दे प्रगति गी बढ़ावा देने ते संभवत: अंतर्जात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं गी दबाने आस्तै अप्रत्यक्ष नियंत्रक दे रूप च बी कम्म करी सकदे न इनें नियंत्रक मेटाबोलाइट्स दी कार्यात्मक भूमिका दा होर वर्णन एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया गी बधाने आस्तै वैकल्पिक रणनीतियां खोली सकदा ऐ ।
मरीजें दे नमूने ते क्लिनिकल डेटा कनाडा दे टिशू रिपोजिटरी नेटवर्क आसेआ प्रमाणत बीसी कैंसर ट्यूमर टिशू रिपोजिटरी दे माध्यम कन्नै हासल कीता गेआ। बीसी कैंसर रिसर्च एथिक्स कमेटी ते ब्रिटिश कोलंबिया यूनिवर्सिटी (H07-00463) आसेआ मंजूर कीते गेदे प्रोटोकॉल दे अनुसार, सब्भै मरीजें दे नमूनें ते क्लिनिकल डेटा हासल कीते गेदे सूचित लिखत सहमति जां औपचारिक रूप कन्नै उंदी सहमति माफ करी दित्ती गेई। नमूनें गी प्रमाणित बायोबैंक (बीआरसी-00290) च संग्रहीत कीता जंदा ऐ। मरीज दी विस्तृत विशेषताएं गी तालिका S1 ते S5 च दिक्खेआ गेआ ऐ। क्रायोप्रिजर्वेशन आस्तै, मरीज दे ट्यूमर दे नमूने गी यंत्रवत रूप कन्नै विघटन करने आस्तै इक स्कैलपेल दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ ते फिर इसगी 100 माइक्रोन फिल्टर दे माध्यम कन्नै धकेलने आस्तै इक कोशिका निलंबन हासल कीता जंदा ऐ। मरीज दे जलन गी 1500 आरपीएम पर 10 मिनट तगर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ तां जे कोशिकाएं गी गोली बनाई सकै ते सुपरनेटेंट गी हटाया जाई सकै। ट्यूमर ते जलन थमां हासल कोशिकाएं गी 50% गर्मी-निष्क्रिय मनुक्खी एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 40% आरपीएमआई-1640 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) ते 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड च क्रायोप्रिजर्व कीता गेआ। इनें संरक्षित इकल कोशिका निलंबन गी पिघलाया गेआ ते मेटाबोलोमिक्स ते मेटाबोलाइट निर्धारण आस्तै इस्तेमाल कीता गेआ जेह् ड़ा हेठ दित्ते गेदे वर्णत ऐ ।
पूरा माध्यम च 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर 50:50 पूरक आरपीएमआई 1640: AimV शामल ऐ। आरपीएमआई 1640 + 2.05 मिमी एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) 10% गर्मी-निष्क्रिय मनुक्खी एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 12.5 मिमी हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) फिशर साइंटिफिक), 1 एक्स कन्नै पूरक पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (PenStrep) घोल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) ते 50 μMB-मर्कैप्टोइथानॉल। AimV (इन्विट्रोजन) गी 20 मिमी हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक) ते 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) कन्नै पूरक कीता जंदा ऐ। फ्लो साइटोमीटर धुंधलापन बफर च 0.22μm फ़िल्टर फास्फेट बफर खारा (पीबीएस; इन्विट्रोजन) 3% गर्मी-निष्क्रिय एबी मानव सीरम (सिग्मा) कन्नै पूरक हा। कोशिका संवर्धन बफर 0.22μm फ़िल्टर कीते गेदे पीबीएस कन्नै बने दा ऐ ते 0.5% गर्मी-निष्क्रिय मनुक्खी एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच) कन्नै पूरक ऐ ।
37 डिग्री सेल्सियस दे पूर्ण माध्यम च कोशिकाएं गी 10 एनएम एमटी डीआर ते 100 माइक्रोन 2-एनबीडीजी कन्नै 30 मिनट तगर दाग दित्ता गेआ। अगले, कोशिकाएं गी 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तगर व्यवहार्यता डाई eF506 कन्नै रंगेआ गेआ। कोशिकाएं गी एफसी ब्लॉक (ईबायोसाइंस) ते ब्रिलियंट स्टेन बफर (बीडी बायोसाइंसेज) च फिरी निलंबित करो, फ्लो साइटोमीटर दाग बफर च पतला करो (निर्माता दे निर्देशें दे अनुसार), ते कमरे दे तापमान पर 10 मिनट तगर इन्क्यूब करो। कोशिकाएं गी एंटीबॉडी दे सेट (तालिका S2) कन्नै फ्लो साइटोमेट्री दाग ​​बफर च 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट तगर दाग लाओ । विश्लेषण थमां पैह् ले कोशिकाएं गी फ्लो साइटोमेट्री धुंधलापन बफर (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R विन्यास) च फिरी निलंबित करो। सेल गिनती डेटा दा विश्लेषण करने लेई स्पेक्ट्रोफ्लो ते फ्लोजो वी10 दा उपयोग करो, ते डेटा बनाने लेई ग्राफपैड प्रिज्म 8 दा इस्तेमाल करो। 2-एनबीडीजी ते एमटी डीआर दी माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) गी लॉग-सामान्य कीता गेआ हा, ते उसदे बाद मिलान मरीजें दा लेखा-जोखा देने आस्तै सांख्यिक विश्लेषण आस्तै इक जोड़ीदार टी परीक्षण दा इस्तेमाल कीता गेआ हा। विश्लेषण थमां 40 शा घट्ट घटनाएं आह् ली सब्भै आबादी गी हटाना; सांख्यिक विश्लेषण ते डेटा विज़ुअलाइज़ेशन करने थमां पैह् ले कुसै बी नकारात्मक मूल्यें लेई 1 दा एमएफआई मान दर्ज करो।
उपर्युक्त प्रक्रिया पैनल दी मैन्युअल गेटिंग रणनीति गी पूरक करने आस्तै, असें फ्लोजो च मृत कोशिकाएं गी खत्म करने दे बाद कोशिकाएं गी स्वचालित रूप कन्नै आबादी च असाइन करने आस्तै आकृति प्रतिबंध पेड़ (FAUST) (21) आसेआ पूरी एनोटेशन दा इस्तेमाल कीता। अस मैन्युअल रूप कन्नै उनें आबादी गी मर्ज करने आस्तै आउटपुट दा प्रबंधन करदे आं जेह् ड़ी गलत आबंटन (पीडी 1 + गी पीडी 1-ट्यूमर कोशिकाएं कन्नै जोड़ना) ते बरकरार आबादी गी मर्ज करने आस्तै करदे आं । हर नमूने च औसतन 2% शा मते कोशिकाएं होंदियां न, कुल 11 आबादी आस्तै।
पीबीएमसी गी ल्यूकोसाइट्स बक्ख-बक्ख उत्पादें (STEMCELL Technologies) थमां बक्ख करने आस्तै फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन दा इस्तेमाल कीता गेआ। सीडी 8 + टी कोशिकाएं गी सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) दा उपयोग करियै पीबीएमसी थमां अलग कीता गेआ ते निर्माता दे निर्देशें दे अनुसार 2 हफ्ते तगर ट्रांसएक्ट (मिल्टेनी) दा उपयोग करियै पूर्ण माध्यम च विस्तार कीता गेआ। कोशिकाएं गी आईएल-7 (10 एनजी/एमएल; पेप्रोटेक) युक्त पूर्ण माध्यम च 5 दिनें तगर खड़ोने दी अनुमति दित्ती गेई, ते उसदे बाद ट्रांसएक्ट कन्नै फिरी उत्तेजित कीता गेआ। 7वें दिन, निर्माता दे निर्देशें दे अनुसार, कोशिकाएं गी लगातार त्रै दौर च समृद्ध करने आस्तै मनुक्खी सीडी 45 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) दा इस्तेमाल कीता गेआ। कोशिकाएं गी फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण आस्तै एलिकोट कीता गेआ हा (जिस चाल्लीं उप्पर दित्ते गेदे न), ते दस लक्ख कोशिकाएं गी एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण आस्तै त्रै बारी एलिकोट कीता गेआ हा। नमूनें गी एलसी-एमएस/एमएस द्वारा संसाधित कीता गेआ जि’यां थमां हेठ दित्ते गेदे न। अस 1,000 दी आयन संख्या कन्नै लापता मेटाबोलाइट मूल्य दा अनुमान लाया। हर नमूने गी कुल आयन संख्या (टीआईसी) कन्नै सामान्य कीता जंदा ऐ, लघुगणकीय रूप कन्नै बदलेआ जंदा ऐ ते विश्लेषण थमां पैह् ले मेटाबोएनालिस्टआर च स्वचालित रूप कन्नै सामान्य कीता जंदा ऐ।
हर इक मरीज दे इकल कोशिका निलंबन गी पिघलाया गेआ ते 40 माइक्रोन दे फ़िल्टर दे माध्यम कन्नै पूरा माध्यम (जि’यां उप्पर दित्ते गेदे न) च छानेआ गेआ। निर्माता दे प्रोटोकॉल दे अनुसार, सीडी 8+, सीडी 4+ ते सीडी 45- कोशिकाएं (बर्फ पर) आस्तै नमूनें गी समृद्ध करने आस्तै माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) दा उपयोग करियै चुंबकीय बीड पृथक्करण कन्नै लगातार त्रै दौर दे सकारात्मक चयन दा इस्तेमाल कीता गेआ। संक्षेप च, कोशिकाएं गी कोशिका संवर्धन बफर (जिस चाल्लीं उप्पर दित्ते गेदे न) च फिरी लटकाया जंदा ऐ ते गिनेआ जंदा ऐ । कोशिकाएं गी मनुक्खी सीडी 8 बीड्स, मनुक्खी सीडी 4 बीड्स जां मनुक्खी सीडी 45 बीड्स (मिल्टेनी) कन्नै 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ हा, ते उसदे बाद कोशिका समृद्धि बफर कन्नै धोया गेआ हा। नमूने गी एलएस स्तंभ (मिल्टेनी) थमां गुजारेआ जंदा ऐ, ते सकारात्मक ते नकारात्मक अंश इकट्ठे कीते जंदे न। अवधि गी घट्ट करने ते कोशिकाएं दी बरामदगी दे कदम गी मती बनाने आस्तै, इसदे बाद सीडी 8-अंश दा इस्तेमाल सीडी 4+ समृद्धि दे दुए दौर आस्तै कीता जंदा ऐ, ते सीडी 4-अंश दा इस्तेमाल बाद च सीडी 45-समृद्धि आस्तै कीता जंदा ऐ पूरे जुदाई प्रक्रिया च घोल गी बर्फ उप्पर रक्खो ।
मेटाबोलाइट्स विश्लेषण आस्तै नमूनें गी तैयार करने आस्तै कोशिकाएं गी इक बारी बर्फ-ठंडे नमक दे घोल कन्नै धोया गेआ हा, ते हर नमूने च 1 मिलीलीटर 80% मिथानल मिलाया गेआ हा, फिर भंवर ते तरल नाइट्रोजन च स्नैप फ्रीज कीता गेआ हा। नमूनें गी त्रै फ्रीज-थॉ चक्र दे अधीन कीता गेआ ते 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तगर 14,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ। मेटाबोलाइट्स युक्त सुपरनेटेंट गी सूखने तकर वाष्पित कीता जंदा ऐ । मेटाबोलाइट्स गी 50 μl 0.03% फार्मिक एसिड च दुबारा घोलिये मिक्स करने आस्तै भंवर कीता गेआ, ते फिर मलबे गी हटाने आस्तै सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ।
मेटाबोलाइट्स गी उप्पर दित्ते गेदे तरीके कन्नै कड्ढो । मेटाबोलोमिक्स अनुसंधान आस्तै सुपरनेटेंट गी उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी बोतल च स्थानांतरित करो। बैच प्रभावें गी रोकने आस्तै हर नमूने गी समान संख्या च कोशिकाएं कन्नै इलाज करने आस्तै बेतरतीब इलाज प्रोटोकॉल दा उपयोग करो । अस एबी एससीआईईएक्स क्यूटीआरएपी 5500 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (50) पर पैह् ले प्रकाशत वैश्विक मेटाबोलाइट्स दा गुणात्मक आकलन कीता। क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण ते पीक एरिया इंटीग्रेशन मल्टीक्वांट संस्करण 2.1 सॉफ्टवेयर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स एससीआईईएक्स) दा उपयोग करियै कीता गेआ।
लापता मेटाबोलाइट्स मूल्य दा अनुमान लाने आस्तै 1000 दी आयन गिनती दा उपयोग कीता गेआ हा, ते हर नमूने दे टीआईसी दा इस्तेमाल हर इक पता लाए गेदे मेटाबोलाइट्स दे सामान्यीकृत चोटी क्षेत्र दी गणना करने आस्तै कीता गेआ हा तां जे नमूने प्रसंस्करण थमां इंस्ट्रूमेंटल विश्लेषण कन्नै पेश कीते गेदे बदलावें गी ठीक कीता जाई सकै। टीआईसी गी सामान्य करने दे बाद, लघुगणकीय रूपांतरण ते स्वचालित नॉर्म लाइन स्केलिंग आस्तै MetaboAnalystR(51) (डिफ़ॉल्ट पैरामीटर) दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ। नमूने दे किस्में दे बश्कार मेटाबोलोम अंतर दा अन्वेषणात्मक विश्लेषण करने आस्तै असें शाकाहारी आर पैकेज कन्नै पीसीए दा इस्तेमाल कीता, ते मरीजें दा विश्लेषण करने आस्तै आंशिक रिडंडेंसी विश्लेषण दा इस्तेमाल कीता। नमूनें दे बिच्च यूक्लिडियन दूरी गी क्लस्टर करने आस्तै हीट मैप डेंड्रोग्राम बनाने आस्तै वार्ड विधि दा उपयोग करो। पूरे कोशिका प्रकार ते सूक्ष्म वातावरण च विभेदक रूप कन्नै प्रचुर मात्रा च मेटाबोलाइट्स दी पन्छान करने आस्तै असें मानकीकृत मेटाबोलाइट्स दी प्रचुरता पर लिम्मा (52) दा इस्तेमाल कीता। व्याख्या गी सरल बनाने आस्तै, अस मॉडल गी निर्दिश्ट करने आस्तै समूह औसत पैरामीटर दा उपयोग करदे आं, ते सूक्ष्म वातावरण च कोशिकाएं दे प्रकारें गी हर समूह (n = 6 समूह) दे रूप च विचार करदे आं; महत्व परीक्षण आस्तै, असें हर मेटाबोलाइट आस्तै त्रै बार-बार माप कीते झूठी प्रतिकृति थमां बचने आस्तै, मरीज गी लिम्मा डिजाइन च बाधा दे रूप च शामल कीता गेआ। बक्ख-बक्ख मरीजें च मेटाबोलाइट्स च अंतर दी जांच करने आस्तै असें मरीजें समेत लिम्मा मॉडल गी इक निश्चित तरीके कन्नै समायोजित कीता। अस कोशिका प्रकार ते Padj <0.05 (बेंजामिनी-होचबर्ग सुधार) दे सूक्ष्म वातावरण दे बश्कार पूर्व-निर्दिष्ट विपरीतता दे महत्व दी रिपोर्ट करदे आं।
मिल्टनी डेड सेल रिमूवल किट (>80% व्यवहार्यता) दा उपयोग करदे होई जोश समृद्धि दे बाद 10x 5′जीन एक्सप्रेशन प्रोटोकॉल दा उपयोग करदे होई कुल जिंदा जमे दे जलोढ़ ते ट्यूमर दे नमूनें पर इकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोम अनुक्रमण कीता गेआ। मिलान ट्यूमर ते जलन दे पंज मामलें दा विश्लेषण कीता गेआ, हालांकि इक ट्यूमर दे नमूने थमां घट्ट व्यवहार्यता ने इसगी शामल करने थमां रोकेआ। मरीजें दे मते सारे चयन हासल करने आस्तै, असें हर मरीज दे नमूनें गी 10x क्रोमियम नियंत्रक दी लेन च इकट्ठा कीता, ते जलन ते ट्यूमर साइटें दा बक्ख-बक्ख विश्लेषण कीता। अनुक्रमण दे बाद [इलुमिना HiSeq 4000 28 × 98 बीपी जोड़ीदार अंत (पीई), क्यूबेक जीनोम; ट्यूमर ते जलन आस्तै औसतन 73,488 ते 41,378 रीड्स प्रति कोशिका क्रमशः]], असें CellSNP ते Vireo (53) (CelSNP दे आधार उप्पर कीऽ GRCh38 द्वारा उपलब्ध करोआए गेदे आम मनुक्खी SNP (VCF) गी दाता दी पन्छान सौंपी जंदी ऐ ।अस मरीज दे जीनोटाइप स्थिति (IBS) दी नजदीकी पन्छान (IBS) दा अनुमान लाने आस्तै SNPRelate दा इस्तेमाल करदे आं, असाइन कीते गेदे कोशिकाएं ते डुप्लेक्स दे रूप च चिह्नित कोशिकाएं गी छोड़ियै ते जलोढ़ ते ट्यूमर दे नमूनें दे बश्कार मिलान करने आह्ले दाताएं गी छोड़ियै इस कम्मै दे आधार उप्पर, अस स्कैटर (55) ते स्क्रैन (56) बायोकंडक्टर पैकेजिंग च इक मास छानने दा कदम करने दे बाद, इस कन्नै 697 कोशिकाएं दी पैदावार कीती गेई (2792 ते 4183 कोशिकाएं, क्रमशः ट्यूमर ते जलन) विश्लेषण आस्तै अस अभिव्यक्ति द्वारा समूह कोशिकाएं गी जैकार्ड दूरी पर आधारत आईग्राफ दे (57) लौवेन क्लस्टरिंग दा उपयोग करदे आं सीडी 8 ए ते जीजेडएमए दी अभिव्यक्ति कन्नै परिभाषित, कम राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ति आह् ले उप-समूहें गी छोड़ियै, अस इज़ार एट अल (16) दे प्रकाशत डेटा गी एक्सेस कीता, जिंदे च उंदी टी-एसएनई एम्बेडिंग बी शामल ऐ, प्रतिरक्षा कोशिका निशान ते एनएनएमटी अभिव्यक्ति दे बश्कार अभिव्यक्ति ओवरलैप गी नियंत्रित करी सकदा ऐ।
पीबीएमसी गी फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै ल्यूकोसाइट्स पृथक्करण उत्पादें (STEMCELL Technologies) थमां बक्ख कीता गेआ। सीडी 3 + कोशिकाएं गी सीडी 3 बीड्स (मिल्टेनी) दा उपयोग करियै पीबीएमसी थमां अलग कीता गेआ। एमएनए दी मौजूदगी जां अनुपस्थिति च सीडी 3 + कोशिकाएं गी प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5μg/ml), घुलनशील सीडी 28 (3μg/ml) ते आईएल-2 (300 U/ml; प्रोल्यूकिन) कन्नै सक्रिय कीता गेआ। विस्तार दे आखरी दिन, व्यवहार्यता (फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई eFluor450, eBioscience) ते प्रसार (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) दा मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री कन्नै कीता गेआ। 4 घैंटें तगर गोल्गीस्टॉप कन्नै पीएमए (20 एनजी/एमएल) ते आयनोमाइसिन (1μg/एमएल) कन्नै कोशिकाएं गी उत्तेजित करियै प्रभावत कम्मै दा मूल्यांकन करो, ते सीडी 8-परसीपी (आरपीए-टी8, बायोलेजेंड), सीडी 4-एएफ700 (आरपीए-टी4) , बायोलेजेंड) ते टीएनएफα-फ्लोरोसेन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) (एमएबी11, बीडी) दी निगरानी करो। 4 घैंटें तगर पीएमए (20 एनजी/एमएल) ते आयनोमाइसिन (1μg/ml) कन्नै qPCR ते ChIP कोशिकाएं गी उत्तेजित करो। एलिसा सुपरनेटेंट गी पीएमए (20 एनजी/एमएल) ते आयनोमाइसिन (1 μg/ml) कन्नै उत्तेजना थमां पैह्ले ते बाद च 4 घैंटें तगर इकट्ठा कीता गेआ।
आरएनईजी प्लस मिनी किट (QIAGEN) दा उपयोग करदे होई आरएनए गी अलग करने लेई निर्माता दे प्रोटोकॉल दा पालन करो। नमूने गी समरूप बनाने लेई QIAshredder (QIAGEN) दा इस्तेमाल करो। पूरक डीएनए (सीडीएनए) दा संश्लेषण करने लेई उच्च क्षमता आह् ली आरएनए ते सीडीएनए किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) दा उपयोग करो। निम्नलिखित जांचें कन्नै जीन अभिव्यक्ति (निर्माता दे प्रोटोकॉल दे अनुसार) गी मात्राबद्ध करने आस्तै TaqMan रैपिड एडवांस्ड मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) दा उपयोग करो: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [हाइड्रोजन (GAPDH) बंद ग्लिसरलडीहाइड-3-फास्फेट] ते Hs01010726_m1 (SLC22A2)। नमूनें गी माइक्रोएम्प ऑप्टिकल फिल्म कन्नै माइक्रोएम्प फास्ट ऑप्टिकल 96-वेल रिएक्शन प्लेट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) च स्टेपवनप्लस रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) (एप्लाइड बायोसिस्टम) पर चलाया गेआ हा। कोई बी Ct मान जेह् ड़ा 35 शा मता ऐ, उसी पता लाने दी सीमा थमां उप्पर मन्नेआ जंदा ऐ ते इसगी पता नेईं लाने आह् ले दे रूप च चिऱन्नत कीता जंदा ऐ।
चिप गी पैह् ले वर्णत तरीके कन्नै करो (58)। संक्षेप च, कोशिकाएं गी फार्माल्डीहाइड (अंतिम सांद्रता 1.42%) कन्नै इलाज कीता गेआ ते कमरे दे तापमान पर 10 मिंट तगर इन्क्यूब कीता गेआ। 10 मिनट तगर बर्फ पर पूरक सूजन बफर (25 मिमी हेपस, 1.5 मिमी MgCl2, 10 मिमी केसीएल ते 0.1% एनपी-40) दा इस्तेमाल करो, फिर इम्यूनोप्रीसिपिटेशन बफर च फिरी लटकाओ जि’यां वर्णत कीता गेआ ऐ (58) । इसदे बाद नमूने गी निम्नलिखित चक्रें कन्नै सोनिकेशन कीता गेआ: 10 चक्र (20 1-सेकंड दाब) ते 40 सेकंड दा इक स्थिर समें। ChIP-ग्रेड इम्यूनोग्लोबुलिन जी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 1μl), हिस्टोन H3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ते SP1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl) एंटीबॉडी गी नमूने कन्नै 4°CC शेक पर रातीं-रात इन्क्यूब करो। प्रोटीन ए बीड्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) गी नमूने कन्नै 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटे तगर हल्के ढंगै कन्नै हिलाने कन्नै इन्क्यूब करो, फिर डीएनए गी समृद्ध करने आस्तै चेलेक्स बीड्स (बायो-रैड) दा इस्तेमाल करो, ते प्रोटीन पाचन आस्तै प्रोटीनेज के (थर्मो फिशर) दा इस्तेमाल करो। TNFα प्रमोटर दा पता पीसीआर द्वारा लाया गेआ: अग्गें, जीजीजी टैट सीसीटी टीजीए टीजीसी टीटीजी टीजीटी; उल्टा, जीटीजी सीसीए एसीए एक्ट जीसीसी टीटीटी एटीए टीजी (207-बीपी उत्पाद)। छवियें गी इमेज लैब (बायो-रैड) आसेआ तैयार कीता गेआ हा ते इमेजजे सॉफ्टवेयर दा उपयोग करियै मात्रा निर्धारत कीती गेई ही।
कोशिका संवर्धन सुपरनेटेंट गी उप्पर दित्ते गेदे तरीके कन्नै इकट्ठा कीता गेआ। निर्धारण मनुक्खी TNFα एलिसा किट (Invitrogen), मनुक्खी IL-2 ELISA किट (Invitrogen) ते मनुक्खी IFN-γ ELISA किट (Abcam) दी निर्माता दी प्रक्रिया दे अनुसार कीता गेआ। निर्माता दे प्रोटोकॉल दे अनुसार सुपरनेटेंट गी TNFα ते IL-2 दा पता लाने आस्तै 1:100, ते IFN-γ दा पता लाने आस्तै 1:3 पतला कीता गेआ। 450 एनएम पर अवशोषण गी मापने आस्तै एनविजन 2104 मल्टीलेबल रीडर (पर्किनएलमर) दा उपयोग करो।
पीबीएमसी गी ल्यूकोसाइट्स पृथक्करण उत्पादें (STEMCELL Technologies) थमां फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै बक्ख कीता गेआ। सीडी 3 + कोशिकाएं गी सीडी 3 बीड्स (मिल्टेनी) दा उपयोग करियै पीबीएमसी थमां अलग कीता गेआ। एमएनए दी मौजूदगी जां अनुपस्थिति च सीडी 3+ कोशिकाएं गी प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5μg/ml), घुलनशील सीडी 28 (3μg/ml) ते आईएल-2 (300 U/ml; प्रोल्यूकिन) कन्नै 3 दिनें तगर सक्रिय कीता गेआ। 3 दिनें दे बाद कोशिकाएं गी इकट्ठा करियै 0.9% खारा पानी कन्नै धोया गेआ, ते गोली गी स्नैप फ्रीज कीता गेआ। कोशिका गिनती 123count eBeads दा उपयोग करदे होई फ्लो साइटोमेट्री (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कॉन्फ़िगरेशन) कन्नै कीती गेई।
मेटाबोलाइट्स गी उप्पर दित्ते गेदे तरीके कन्नै कड्ढो । सूखे अर्क गी 4000 कोशिका समतुल्य/μl दी सांद्रता च पुनर्गठित कीता गेआ। रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (1290 इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) ते CORTECS T3 स्तंभ (2.1×150 मिमी, कण आकार 1.6-μm, छिद्र आकार 120-Å; #186008500, वाटर्स) कन्नै नमूने दा विश्लेषण करो। ध्रुवीय मास स्पेक्ट्रोमीटर (6470, एजिलेंट), जिस च इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण सकारात्मक मोड च कम्म करदा ऐ। मोबाइल फेज ए 0.1% फार्मिक एसिड (H2O च), मोबाइल फेज बी 90% एसीटोनिट्राइल, 0.1% फार्मिक एसिड ऐ। एलसी ढाल 100% ए आस्तै 0 थमां 2 मिनट, 99% बी आस्तै 2 थमां 7.1 मिनट, ते 99% बी आस्तै 7.1 थमां 8 मिनट ऐ , फिर स्तंभ गी मोबाइल चरण ए कन्नै 3 मिनट तगर 0.6 मिलीलीटर/मिनट दी प्रवाह दर कन्नै फिरी संतुलित करो। . प्रवाह दर 0.4ml/min ऐ, ते स्तंभ कक्ष गी 50°C तगर गरम कीता जंदा ऐ। रिटेन टाइम (आरटी) ते रूपांतरण (आरटी = 0.882 मिनट, रूपांतरण 1 = 137→94.1, रूपांतरण 2 = 137→92 , रूपांतरण 3 = 137→78) स्थापित करने लेई एमएनए दे शुद्ध रसायन मानक (M320995, टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी, उत्तरी यार्क, ओंटारियो, कनाडा) दा उपयोग करो। जदूं त्रैनें संक्रमण सही रिटेन समें पर होंदे न तां विशेशता गी सुनिश्चित करने आस्तै संक्रमण 1 दा उपयोग मात्रा निर्धारण आस्तै कीता जंदा ऐ। एमएनए (टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) दी मानक वक्रता गी स्टॉक घोल (1 मिलीग्राम/एमएल) दे छह सीरियल पतलापन कन्नै पैदा कीता गेआ तां जे क्रमशः 0.1, 1.0, 10 ते 100 एनजी/एमएल ते 1.0 ते 10μg/एमएल तरल दे मानक हासल कीते गे। पता लाने दी सीमा 1 एनजी/एमएल ऐ, ते रेखीय प्रतिक्रिया 10 एनजी/एमएल ते 10μg/एमएल दे बश्कार ऐ । नमूने ते मानक दे हर इक इंजेक्शन दा उपयोग एलसी/एमएस विश्लेषण आस्तै कीता जंदा ऐ, ते विश्लेषण मंच दी स्थिरता गी सुनिश्चित करने आस्तै हर अट्ठ इंजेक्शनें च इक मिश्रित गुणवत्ता नियंत्रण नमूना चलाया जंदा ऐ। सारे एमएनए-उपचारित कोशिका नमूनें दी एमएनए प्रतिक्रियाएं परख दी रेखीय सीमा दे अंदर ही। डेटा विश्लेषण मासहंटर मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (v9.0, एजिलेंट) दा उपयोग करियै कीता गेआ।
दूसरी पीढ़ी दा αFR-CAR निर्माण सोंग एट अल थमां लैता गेआ हा। (59) दा। संक्षेप च, निर्माण च निम्नलिखित सामग्री शामल ऐ: सीडी 8ए लीडर अनुक्रम, मनुक्खी αFR-विशिष्ट इकल श्रृंखला चर टुकड़ा, सीडी 8ए काज ते ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र, सीडी 27 इंट्रासेलुलर डोमेन ते सीडी 3जे इंट्रासेलुलर डोमेन। पूरा सीएआर अनुक्रम गी जेनस्क्रिप्ट द्वारा संश्लेषित कीता गेआ हा, ते फिर ट्रांसडक्शन दक्षता दा मूल्यांकन करने आस्तै इस्तेमाल कीते गेदे जीएफपी एक्सप्रेशन कैसेट दे अपस्ट्रीम च दूई पीढ़ी दे लेन्टिवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर च क्लोन कीता गेआ हा।
लेन्टीवायरस HEK293T कोशिकाएं दे संक्रमण कन्नै पैदा होंदा ऐ [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC); दुलबेको दे संशोधित ईगल माध्यम च उगाया जंदा ऐ जिस च 10% भ्रूण गोहे सीरम (FBS) ते 1% PenStrep होंदा ऐ, ते CAR-GFP वेक्टर दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ ते पैकेजिंग प्लाज्मिड (psPAX2 ते pMD2.G, Addgene) च लिपोफेक्शन अमाइन (Sigma-Aldrich) दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ वायरस युक्त सुपरनेटेंट गी ट्रांसफेक्टेशन दे 48 ते 72 घैंटें बाद इकट्ठा कीता गेआ, छानने ते अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै गाढ़ा कीता गेआ। गाढ़ा वायरस सुपरनेटेंट गी -80 डिग्री सेल्सियस पर संप्रेषण तगर संग्रहीत करो।
पीबीएमसी गी फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै सेह्तमंद दाता ल्यूकोसाइट्स पृथक्करण उत्पादें (STEMCELL Technologies) थमां बक्ख कीता जंदा ऐ। पीबीएमसी थमां सीडी 8+ कोशिकाएं गी अलग करने आस्तै सकारात्मक चयन सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) दा उपयोग करो। ट्रांसएक्ट (मिल्टेनी) कन्नै ते टेक्समैक्स माध्यम च टी कोशिकाएं गी उत्तेजित करना [मिल्टेनी; 3% गर्मी-निष्क्रिय मनुक्खी सीरम, 1% पेनस्ट्रेप ते आईएल-2 (300 U/ml)] कन्नै पूरक कीता गेआ। उत्तेजना दे 24 घैंटे बाद टी कोशिकाएं गी लेन्टीवायरस (10 μl गाढ़ा वायरस सुपरनेटेंट प्रति 106 कोशिकाएं) कन्नै ट्रांसड्यूस कीता गेआ। साइटेक अरोड़ा (एफएससी (फॉरवर्ड स्कैटर)/एसएससी (साइड स्कैटर) पर, सिंगलेट, जीएफपी + पर संप्रेषण दे 1 थमां 3 दिनें बाद, कोशिकाएं दी GFP अभिव्यक्ति दा मूल्यांकन करियै घट्ट शा घट्ट 30% संप्रेषण दक्षता दा प्रदर्शन करो
CAR-T कोशिकाएं गी इम्यूनोकल्ट (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep कन्नै पूरक) च 24 घैंटें तगर निम्नलिखित शर्तें कन्नै संस्कार कीता गेआ: बिना इलाज, 250 μM एडेनोसाइने जां 10 mM MNA कन्नै इलाज कीता गेआ। पूर्व-इलाज दे बाद सीएआर-टी कोशिकाएं गी पीबीएस कन्नै धोया गेआ ते 20,000 एसके-ओवी-3 कोशिकाएं कन्नै जोड़ेआ गेआ [एटीसीसी; मैककोय 5ए माध्यम (सिग्मा-एल्ड्रिच) च 10% एफबीएस ते 1% पेनस्ट्रेप कन्नै पूरक कीता गेआ : 1 दे प्रभावक ते लक्ष्य अनुपात गी पूरक इम्यूनोकल्ट माध्यम च त्रै प्रतियां च प्रवर्धित कीता गेआ। डिजिटलिस सैपोनिन (0.5mg/ml; सिग्मा-एल्ड्रिच) कन्नै लाइज कीते गेदे एसके-ओवी-3 कोशिकाएं ते एसके-ओवी-3 कोशिकाएं गी क्रमशः नकारात्मक ते सकारात्मक नियंत्रण दे रूप च इस्तेमाल कीता गेआ। 24 घैंटें दे सह-खेती दे बाद सुपरनेटेंट गी इकट्ठा करियै लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) गी निर्माता दे निर्देशें (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) दे अनुसार मापा गेआ। एलडीएच सुपरनेटेंट गी एलडीएच बफर च 1:50 पतला कीता गेआ। हत्या दा प्रतिशत निम्नलिखित सूत्र दा उपयोग करदे होई मापा गेआ हा: हत्या दा प्रतिशत = सुधार दा प्रतिशत / अधिकतम हत्या दर x 100%, जित्थें सुधार दा प्रतिशत = सिर्फ सह-संस्कृति-टी कोशिकाएं, ते मती हत्या दर = सकारात्मक नियंत्रण-नकारात्मक नियंत्रण।
जि’यां पाठ जां सामग्री ते तरीकें च दस्सेआ गेआ ऐ, सांख्यिक विश्लेषण आस्तै ग्राफपैड प्रिज्म 8, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल जां आर v3.6.0 दा इस्तेमाल करो। जेकर इक गै मरीज थमां मते सारे नमूने इकट्ठे कीते जंदे न (जियां जलन ते ट्यूमर), तां अस इक जोड़ीदार टी परीक्षण दा उपयोग करदे आं जां मरीज गी उचित रूप कन्नै रेखीय जां सामान्यीकृत मॉडल च बेतरतीब प्रभाव दे रूप च शामल करदे आं । मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण आस्तै महत्व परीक्षण त्रै प्रतियां च कीता जंदा ऐ ।
इस लेख आस्तै पूरक सामग्री आस्तै कृपा करियै दिक्खो http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
एह् इक खुल्लै एक्सेस लेख ऐ जेह् ड़ा क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-व्यावसायिक लाइसेंस दी शर्तें दे तैह् त बंड कीता गेदा ऐ, जेह् ड़ा कुसै बी माध्यम च इस्तेमाल, वितरण ते प्रजनन दी अनुमति दिंदा ऐ, जदूं तगर अंतिम इस्तेमाल व्यावसायिक फायदे आस्तै नेईं ऐ ते आधार ऐ जे मूल कम्मै दा सही ऐ। हवाला।
नोट: अस तुसेंगी सिर्फ अपना ईमेल पता देने लेई आखने आं तां जे जिस माह् नू गी तुस पेज पर सिफारिश करदे ओ ओह् जानन जे तुस चाह्न्दे ओ जे ओह् ईमेल दिक्खन ते एह् स्पैम नेईं ऐ। अस कुसै बी ईमेल पते गी कैप्चर नेईं करगे।
इस सवाल दा इस्तेमाल इस गल्लै गी परखने लेई कीता जंदा ऐ जे तुस विजिटर ओ जां नेईं ते स्वचालित स्पैम जमा करने गी रोकने लेई कीता जंदा ऐ।
मारिसा के जी जोन्स), फिनेस टी हैमिल्टन (फिनेस टी।
एमएनए टी कोशिकाएं दे प्रतिरक्षा दमन च योगदान दिंदा ऐ ते मनुक्खी कैंसर दे इलाज आस्तै इक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ ।
मारिसा के जी जोन्स), फिनेस टी हैमिल्टन (फिनेस टी।
एमएनए टी कोशिकाएं दे प्रतिरक्षा दमन च योगदान दिंदा ऐ ते मनुक्खी कैंसर दे इलाज आस्तै इक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ ।
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