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रीढ़ दी हड्डी दे विपरीत, कीड़े-मकोड़े च व्यापक रूप कन्नै नर-पक्षपातपूर्ण सेक्स स्टेरॉयड हार्मोन दी कमी समझेआ जंदा ऐ ।एनोफिलिस गैम्बिया च, एकडाइसोन स्टेरॉयड 20-हाइड्रोक्सीएक्डाइसोन (20E) दा विकास मादाएं आसेआ संश्लेषित होने पर अंडे दे विकास गी नियंत्रित करने आस्तै ते नर द्वारा यौन स्थानांतरण होने पर संभोग प्रतिरोधक अवधि गी प्रेरित करने आस्तै दिक्खेआ जंदा ऐ3.अंडे दे विकास थमां ते संभोग जरूरी प्रजनन लक्षण न, एह् समझना जे मादा एनोफिलिस मच्छर इनें हार्मोनल संकेतें गी किस चाल्ली इकट्ठा करदे न, नमें मलेरिया नियंत्रण कार्यक्रमें दे डिजाइन च सुविधाजनक होई सकदा ऐ।इत्थें, अस पता लाने आं जे एह् प्रजनन कार्य ecdysteroid-सक्रिय/निष्क्रिय करने आह्ले एन्जाइमें दे इक जटिल नेटवर्क दे माध्यम कन्नै अलग-अलग सेक्स स्टेरॉयड द्वारा नियंत्रित कीते जंदे न।असें इक नर-विशिष्ट आक्सीडाइज्ड एक्डीसोन, 3-डिहाइड्रो-20E (3D20E), जेह्ड़ा यौन स्थानांतरण ते डिफॉस्फोरिलेशन कन्नै सक्रियकरण दे बाद महिलाएं दी यौन ग्रहणशीलता गी बंद करियै माता-पिता दी रक्षा करदा ऐ ।उल्लेखनीय रूप कन्नै, 3D20E हस्तांतरण ने प्रजनन जीन दी अभिव्यक्ति गी बी प्रेरित कीता जेह्ड़े प्लाज्मोडियम संक्रमण दे दौरान अंडे दे विकास गी बनाए रखदे न, जिस कन्नै संक्रमित महिलाएं दी सेह्त गी सुनिश्चित कीता जंदा ऐ।महिला-उत्पन्न 20E यौन ग्रहण नेईं पैदा करदा ऐ प्रतिक्रिया, पर 20E-निरोधक किनारे दे बाद संभोग करने आह्ले व्यक्तिएं गी अंडे देने दी अनुमति दिंदा ऐ
मलेरिया दे मामले ते मौतें च फिरी बद्धोबद्ध होआ करदा ऐ4 मनुक्खी मलेरिया परजीवी दा इकमात्र संवाहक एनोफिलिस मच्छरें च व्यापक कीटनाशक प्रतिरोधक क्षमता दे कारण।इ’नें मच्छरें दा संभोग जीव विज्ञान नवीन मलेरिया नियंत्रण हस्तक्षेपें आस्तै इक खास आकर्षक लक्ष्य ऐ कीजे मादाएं दा संभोग सिर्फ इक बारी गै होंदा ऐ इस इकल संभोग घटना गी बाँझ बनाने कन्नै खेतर च मच्छरें दी आबादी गी घट्ट करने दी बड़ी संभावना होग।
पुरुषें थमां उच्च टाइटर स्टेरॉयड हार्मोन मिलने दे बाद महिलाएं यौन अक्षम होई जंदियां न ।अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे होर संभोग च दिक्कत दा ट्रिगर 20-हाइड्रोक्सीएक्डाइसोन (20E) ऐ, जेह्ड़ा इक स्टेरॉयड हार्मोन ऐ जेह्ड़ा लार्वा दे चरण च मोल्टिंग चक्र दे नियंत्रक दे रूप च मता जानेआ जंदा ऐ ।नरें दी 20E गी संश्लेषण ते स्थानांतरित करने दी क्षमता च विशेश रूप कन्नै विकसित होई ऐ एनोफिलिस प्रजाति जेह् ड़ी उप-जीनस सेलिया7 दा हिस्सा ऐ , जेह्ड़ी अफ्रीका च बंड्डी जंदी ऐ ते मलेरिया दे सारें शा खतरनाक संवाहक शामल न , जिंदे च एनोफिलिस गैम्बिया बी शामल न ।एह् खास करियै उल्लेखनीय ऐ की जे इनें प्रजातियें च मादा हर खून दे खाने दे बाद बी 20E पैदा करदियां न , ते 20E ओजेनेसिस चक्र गी चलांदी ऐ (देखो संदर्भ 8 ) ।हालांके , मादाएं दे इकीकरण दे तरीके दे बारे च मता किश नेईं जानदे न इकडाइसोन दे दो बक्ख-बक्ख स्रोतें (पुरुष स्थानांतरण ते खून खिलाने दे प्रेरण) थमां संकेत दिंदे न जेह्दे कन्नै अपनी संभोग दी क्षमता कन्नै समझौता नेईं कीता जंदा ऐ ।असल च जेकर मादाएं आसेआ पैदा कीता गेदा 20ई यौन असहिष्णुता गी शुरू करदा ऐ तां इस कन्नै कुंवारी खिलाने आह्ले व्यक्तियें च बांझपन पैदा होई जाग , जेह्ड़ा इनें मच्छरें च इक बड़ा आम व्यवहार ऐ
इक संभावित सफाई एह् ऐ जे ए.गैम्बिया नर इक संशोधित नर-विशिष्ट एक्डीसोन दा स्थानांतरण करदे न, जेह्ड़ा मादा प्रजनन मार्ग च इक संकेत झरना सक्रिय करदा ऐ, जिसदे फलस्वरूप संभोग अस्थिरता पैदा होंदी ऐ ।हालांके, हालांकि रीढ़ दे हड्डी आह्ले जीवें च मते सारे स्टेरॉयड हार्मोन होंदे न, जि’यां एस्ट्रोजन ते एंड्रोजन (संदर्भ 9 च समीक्षा कीती गेई ऐ), साढ़ी जानकारी दे अनुसार, एंड्रोजेनिक-पक्षपात आह्ले स्टेरॉयड दी पन्छान इस च नेईं कीती गेई ऐ कीड़े-मकोड़े।
अस संभावित संशोधन स्टेरॉयड दी तलाश च यौन रूप कन्नै परिपक्व ए.गैम्बिया दे नर पुरुष सहायक ग्रंथि (MAG) च स्टेरॉयड हार्मोन दे रेपर्टरी दा निर्धारण करने आस्तै रवाना होए।पैह्ले इस्तेमाल कीती गेदी कम विशिष्ट विधि दी बजाय टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-MS/MS) कन्नै जुड़ी दी उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी दा इस्तेमाल करदे होई, असें इस ऊतक च एकडिसोन (E) ते 20E दा पता लाया, जिसदे कन्नै पैह्ले दी पुष्टि होई result.हालांके, नमूने च ऑक्सीडाइज्ड फास्फोरिलेशन स्टेरॉयड दा बोलबाला हा, जेह्ड़ा सूत्र 3-डीहाइड्रो-20E22P)12 (चित्र 1) दे अनुरूप हा।दूए रूपें च 3-डीहाइड्रो-20E (3D20E) ते 20E-22-फास्फेट (20E22P) शामल न।एचपीएलसी-एमएस/एमएस संकेत दी तीव्रता 3D20E22P अपने डिफॉस्फोरिलेशन रूप, 3D20E, ते ई ते 20E (चित्र 1) थमां त्रै आर्डर दी परिमाण च मता हा।हालांके शरीर दे होर हिस्सें ते निचले प्रजनन मार्ग च (एलआरटी; विस्तारित डेटा चित्रा 1a)।असें नमें बंद (<1 दिन पुराने) नर ते... महिलाएं ते सिर्फ एमएजी च 3D20E ते 3D20E22P दा पता लाया; ई, 20ई ते 20ई22पी दौनें लिंगें च मौजूद हे (विस्तारित आंकड़े चित्र 1 बी)।एह् आंकड़े दस्सदे न जे ए.गैम्बिया वयस्क नर अपने एमएजी च संशोधन हार्मोन दे उच्च टिटर पैदा करदे न जेह्ड़े मादाएं आसेआ संश्लेषित नेईं होंदे न
एमएजी ते मादा एलआरटी (जिंदे च अलिंद, वीर्य पुटिका, ते पैरोवेरियम शामल न) गी 4 दिनें दे (4 दिनें दे) कुंवारी नर ते कुंवारी ते संभोग कीती गेदी मादाएं (0.5, 3, ते 12 एचपीएम) थमां विच्छेदन कीता गेआ हा।इ’नें ऊतकें च इक्डाइसोन दा विश्लेषण एचपीएलसी-एमएस/एमएस (मध्यम ± सेम; बिना जोड़ीदार टी-टेस्ट, दो-पक्षीय, दो-पक्षीय,) कन्नै कीता गेआ हा। झूठी खोज दर (एफडीआर) सही कीता गेआ; 3 घैंटे बनाम 0.5 घैंटे, पी = 0.25;12 घैंटे बनाम 3 घैंटे, पी = 0.0032;12 घैंटे बनाम 0.5 घैंटे, पी = 0.015)।डेटा त्रै जैविक प्रतिकृतियें थमां न।ब्याज दे हर इकडाइसोन आस्तै चोटी क्षेत्र दी गणना कीती गेई ही ते मच्छरें दी संख्या कन्नै सामान्य कीता गेआ हा।एक्डीसोन गी रंग कन्नै इस चाल्ली दर्शाया गेआ ऐ: ई, हरा 20ई, नारंगी रंग दा; 20ई22पी, बैंगनी रंग दा; 3 डी20ई, नीले रंग दा; 3D20E22P, गुलाबी।इनसेट वाई-अक्ष पर पैमाने गी बधांदा ऐ तां जे निचले एकडाइसोन स्तर गी दस्सेआ जाई सकै।
इस गल्ल दी जांच करने आस्तै जे संभोग दे दौरान 3D20E22P ते 3D20E दा स्थानांतरण कीता जंदा ऐ जां नेईं, अस संभोग दे बाद बक्ख-बक्ख समें बिंदुएं पर मादा एलआरटी दा विच्छेदन कीता।हालांके कुंवारी च इकडाइसोन नेईं पाया गेआ, पर संभोग दे फौरन बाद एलआरटी च 3D20E22P दी काफी मात्रा दिक्खी गेई (0.5 घैंटें संभोग दे बाद, एचपीएम), समें कन्नै घट्ट होई गेई, जिसलै के 3D20E दे स्तर च काफी बद्धोबद्ध होआ (चित्र 1)।रासायनिक रूप कन्नै संश्लेषित 3D20E दा इक मानक दे रूप च इस्तेमाल करदे होई असें एह् निर्धारत कीता जे संभोग एलआरटी च इस स्टेरॉयड हार्मोन दा स्तर 20E थमां घट्ट शा घट्ट 100 गुना मता ऐ (विस्तारित डेटा तालिका 1)।इस चाल्ली, 3D20E22P इक प्रमुख नर एकडिसोन ऐ जेह्ड़ा संभोग दे दौरान मादा एलआरटी च स्थानांतरित होंदा ऐ, ते इसदा डिफॉस्फोरिलेशन रूप, 3D20E, संभोग दे थोड़े गै समें बाद मती मात्रा च होंदा ऐ ।इस कन्नै मादा संभोग दे बाद दे जीव विज्ञान च बाद च इकडाइसोन आस्तै इक महत्वपूर्ण भूमिका दा सुझाऽ दित्ता जंदा ऐ ।
इक नमें आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) डाटासेट (चित्र 2a) पैदा करने दे बाद, इक कस्टम-निर्मित बायोइन्फोर्मैटिक्स पाइपलाइन दा उपयोग करदे होई, असें इकडाइसोन किनारे (EcK), ecdysone oxidase (EO), ते ecdysone एन्कोडिंग 20E-संशोधित फॉस्फेटेज जीन.EPP) प्रजनन ऊतकें च व्यक्त कीता जंदा ऐ।असें इक उम्मीदवार ईपीपी जीन ते दो दी पन्छान कीती संभावित EcK जीन (EcK1 ते EcK2), पर इक अच्छा उम्मीदवार ईओ जीन नेईं पाई सके।उल्लेखनीय रूप कन्नै, व्यक्तिगत ईपीपी जीन गैम्बियाई एमएजी च उच्च स्तर (98.9वां परसेंटाइल) पर व्यक्त कीते गे हे पर महिला एलआरटी च नेईं (चित्र 2b), साढ़ी उम्मीदें दे विपरीत कीजे इस महिला ऊतक च 3D20E22P दा डिफॉस्फोरिलेशन होआ हा।इस करी, अस विश्वास करने आं कि नर ईपीपी संभोग दे दौरान स्थानांतरित कीता जाई सकदा ऐ।वास्तव च, अस संभोग दे बाद मादा प्रोटीन गी मास्क करने आस्तै विवो स्थिर आइसोटोप लेबलिंग दा इस्तेमाल कीता, जेह्ड़ा मादा अलिंद च एमएस द्वारा चिह्नित इक एन्जाइम ऐ (चित्र 2c ते पूरक तालिका 1)।मैजी च ईपीपी दी मौजूदगी ते संभोग (पर कुंवारी नेईं) मादा एलआरटी च बी विशिष्ट एंटीबॉडी दा इस्तेमाल करियै पुष्टि कीती गेई (चित्र 2d)।
क, हर लिंग दे प्रजनन ऊतकें च EcKs, EOs, ते EPPs गी एन्कोड करने आह् ले जीन दी खोज करने आस्तै इक कस्टम-बनाई गेदी बायोइन्फोर्मैटिक्स पाइपलाइन।तीरें दे बगल च नंबर हर कदम पर नर ते मादा उम्मीदवारें दी संख्या गी दर्शांदे न।इस विश्लेषण ने इक ईपीपी जीन (ईपीपी) ते इक ईसीके जीन (EcK1) दी पन्छान कीती जेह् ड़े नर च अभिव्यक्त होंदे न, ते इक ईसीके जीन (EcK2) जेह् ड़ा दौनें लिंगें च अभिव्यक्त होंदा ऐ पर उम्मीदवार ईओ जीन नेईं पैदा करदा ऐ ।बी, कुंवारी (वी) ते संभोग (एम) एनोफिलस गैम्बिया ते एनोफिलिस अल्बिकनस ऊतकें च उम्मीदवार जीन अभिव्यक्ति दी तुलना करदे होई हीटमैप ।Spca, निषेचन नर च मैग, सहायक ग्रंथियां; शरीर दे होर हिस्सें, जिंदे च स्तन, पंख, पैर, मोटे शरीर, ते दौनें लिंगें च अंदरूनी अंग शामल न, ते महिलाएं च अंडाशय शामल न।EcK2 गैंबिया दे एमएजी ते अलिंद दोनें च मती अभिव्यक्त होंदा ऐ, जदके ईपीपी सिर्फ MAG.c च गै पाया जंदा ऐ, पुरुष स्खलन समूह दे स्थानांतरण दा प्रोटीओमिक विश्लेषण 3, 12 ते 24 hpm, 67 सारें शा मते प्रोटीन दस्सदे होई।महिलाएं गी सारे प्रोटीनें गी लेबल (ते मास्क) करने आस्तै 15N युक्त आहार पर पालेआ गेआ हा।अनटैग कीते गेदे नर गी टैग कीती गेदी मादाएं कन्नै संभोग कीता गेआ हा, ते प्रोटीओमिक विश्लेषण आस्तै मादा एलआरटी गी 3, 12 ते 24 एचपीएम पर विच्छेदन कीता गेआ हा (स्खलन प्रोटीन दी पूरी सूची आस्तै पूरक तालिका 1 दिक्खो)।इनसेट, ईपीपी, Eck1 ते इनें ऊतकें दे प्रोटीओमिक विश्लेषण कन्नै कुंवारी नर दे एमएजी च EcK2 दा पता लाया गेआ हा।d, संभोग कीती गेदी मादाएं दे एमएजी ते एलआरटी च वेस्टर्न ब्लॉट कन्नै ईपीपी दा पता लाया गेआ हा, पर कुंवारी मादाएं जां नर जां बाकी मादा शरीर च नेईं।झिल्लीएं दी इक गै समें च एंटी-एक्टिन (लोडिंग कंट्रोल) ते एंटी-ईपीपी एंटीबॉडी कन्नै जांच कीती गेई ही।सभनें नर कुंवारी न।See जेल स्रोत डेटा लेई पूरक चित्र 1।वेस्टर्न ब्लॉट गी दो बारी समान नतीजें कन्नै कीता गेआ।
ईपीपी दी इकडीस्टेरॉइड फास्फेटेज गतिविधि गी एमएजी (विस्तारित डेटा चित्रा 2 ए) थमां अलग कीते गेदे 3D20E22P कन्नै ऊष्मायन दे बाद एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा सत्यापन कीता गेआ हा।इसदे अलावा, जदूं अस आरएनए-मध्यस्थ हस्तक्षेप (आरएनएआई) कन्नै ईपीपी गी चुप कराया, तां असें इनें नर (चित्र 3 ए), ते मादाएं दे प्रजनन ऊतकें च फॉस्फेटेज गतिविधि च मजबूत कमी दा पता लाया ईपीपी-चुप नर कन्नै संभोग कीता गेआ आंशिक जीन चुप होने दे बावजूद डिफॉस्फोरिलेशन 3D20E (चित्र 3 बी) दा इक घट्ट अनुपात (विस्तारित डेटा चित्रा 2b,c)।इसदे विपरीत, असें उस्सै मच्छरें च 20E22P/20E अनुपात च मता बदलाव नेईं पाया, जेह्दे कन्नै एह् सुझाऽ दित्ता जाई सकदा ऐ जे एन्जाइम 3D20E22P आस्तै विशिष्ट ऐ (चित्र ३ख)।
ए, डबल-स्ट्रैंड ईपीपी आरएनए (dsEPP) जां डबल-स्ट्रैंड जीएफपी आरएनए (dsGFP) नियंत्रण दा उपयोग करदे होई ईपीपी साइलेंसिंग दे कारण एमएजी च फॉस्फेटेज गतिविधि च कमी।हर प्रतिलिपि च बीस एमएजी पूल दा इस्तेमाल कीता गेआ (पी = 0.0046, जोड़ीदार टी-टेस्ट, दो-तरफा), बक्ख-बक्ख बिंदुएं कन्नै दर्शाया गेआ।b, ईपीपी-साइलेंड नर कन्नै संभोग कीती गेदी मादाएं च ए 3 एचपीएम पर डिफॉस्फोरिलेशन 3D20E दा काफी घट्ट अनुपात (पी = 0.0043, बिना जोड़ीदार टी-परीक्षण, दो-तरफा), जिसलै के 20E दे स्तर अप्रभावित हे (पी = 0.063, बिना जोड़ीदार)। टी-टेस्ट, दो-तरफा)।डेटा 13, 16 ते 19 मादाएं दे त्रै पूल थमां औसत ± सेम दे रूप च पेश कीता गेआ ऐ।सी, ईपीपी-चुप नर कन्नै संभोग करने आह् ली मादाएं च पुनर्संभोग दी दर काफी उच्च ही (पी = 0.0002, फिशर दा सटीक परीक्षण, दो-पक्षीय)।मादाएं गी पैह् ले संभोग करने लेई मजबूर कीता गेआ हा तां जे उंदी संभोग दी स्थिति गी सुनिश्चित कीता जाई सकै 2 दिनें बाद, उ’नेंगी ट्रांसजेनिक शुक्राणु लेई जाने आह् ले होर नर कन्नै संपर्क कीता गेआ तां जे ट्रांसजीन दे मात्रात्मक पीसीआर पता लाने कन्नै पुनर्संभोग दर दा आकलन कीता जाई सकै।d, ईपीपी-चुप नर कन्नै संभोग करने आह् ली खून कन्नै खिलाने आह् ली मादाएं च प्रजनन क्षमता च काफी कमी आई ही (P < 0.0001; Mann-Whitney test, two-sided) ते अंडे दी संख्या च थोड़ी कमी आई ही (P = 0.088, मान-व्हिटनी परीक्षण, दो-तरफा) , जदके स्पॉनिंग दर प्रभावित नेईं होई (पी = 0.94, फिशर दा सटीक परीक्षण, दो-तरफा)।सभनें पैनल च, n जैविक रूप कन्नै स्वतंत्र मच्छर नमूनें दी संख्या दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ।एनएस, महत्वपूर्ण नेईं।* पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.001 ऐ।
अगले, असें आकलन कीता जे मादाएं च संभोग प्रतिरोधक क्षमता पैदा करने आस्तै इकडाइसोन डिफॉस्फोरिलेशन महत्वपूर्ण ऐ जां नेईं ।उल्लेखनीय रूप कन्नै, ईपीपी-क्षीण नर कन्नै संभोग कीती गेदी मादाएं अतिरिक्त (ट्रांसजेनिक) नर दे संपर्क च औने पर नियंत्रण मादाएं (10.4%) दी तुलना च मती उच्च आवृत्ति (44.9%) पर फिरी संभोग कीता (चित्र 3 ग)।असें प्रजनन क्षमता च बी मती कमी दिक्खी (चित्र 3d, बाएं) ते इनें मादाएं आसेआ दित्ते गेदे अंडे दी गिनतरी च मामूली कमी (चित्र 3d, बिच्च), जिसलै के मादाएं आसेआ दित्ते गेदे अंडे दा प्रतिशत (मादाएं च संभोग कन्नै पैदा होने आह्ली इक होर प्रतिक्रिया )) प्रभावित नेईं होई (चित्र 3d, दाएं)।3D20E22P आस्तै ईपीपी दी दिक्खी गेई विशिष्टता गी दिक्खदे होई, एह् नतीजें दा सुझाऽ दिंदा ऐ जे संभोग दे दौरान स्थानांतरित ईपीपी द्वारा 3D20E दा होर संभोग करने आस्तै महिलाएं दी ग्रहणशीलता गी बंद करने च महत्वपूर्ण भूमिका हो सकदी ऐ , जेह्ड़ा पैह्लें 20E दे यौन स्थानांतरण कन्नै जोड़ेआ जंदा हा .इस करी एह् नर-विशिष्ट हार्मोन महिलाएं दी प्रजनन क्षमता गी बी मजबूती कन्नै प्रभावित करदा ऐ
अगले, अस रासायनिक रूप कन्नै संश्लेषित 3D20E (चित्र 4a–c) ते व्यावसायिक रूप कन्नै उपलब्ध 20E दा इस्तेमाल करदे होई यौन परिपक्व कुंवारी च इंजेक्शन प्रयोगें च 20E ते 3D20E दी गतिविधियें दी तुलना कीती।असें दिक्खेआ जे 3D20E दौनें सांद्रता च संभोग आस्तै महिलाएं दी संवेदनशीलता गी बंद करने च 20E थमां मता प्रभावी हा (चित्र 4d)। एलआरटी च 3D20E दे शारीरिक स्तर (1,066 पीजी इंजेक्शन दे बाद बनाम 2,022 पीजी संभोग दे बाद) ने दुर्दम्य मादाएं दा इक अनुपात प्रेरित कीता जेह्ड़ा 20E (361 पीजी इंजेक्शन दे बाद) दे शारीरिक स्तर थमां 20 गुना मता हा जेह्ड़ा इंजेक्शन दे 24 घैंटे बाद उच्चतम सांद्रता च 18 पीजी संभोग दे बाद विस्तारित आंकड़े तालिका 1).एह् नतीजा इस धारणा कन्नै मेल खंदा ऐ जे 20E दे यौन हस्तांतरण कन्नै संभोग प्रतिरोधक अवधि नेईं होंदा ऐ , ते अग्गें 3D20E गी माता-पिता-बच्चे दे रिश्ते गी सुनिश्चित करने च इक बड्डे कारक दे रूप च इंगित करदा ऐ ।3D20E कुंवारी मादाएं च अंडे देने दे परीक्षण च बी 20E थमां मता सक्रिय हा (चित्र 4e), जिस थमां पता चलदा ऐ जे अंडे देने दी दर सामान्य ऐ आंशिक ईपीपी साइलेंसिंग दे बाद दिक्खेआ गेआ हा जे अवशिष्ट 3D20E गतिविधि दी मौजूदगी दे कारण हा जेह्ड़ी अजें बी संभोग-प्रेरित मादा कारकें आसेआ पैदा कीती गेई ही ।
(a,b) 20E (a) थमां रासायनिक रूप कन्नै संश्लेषित 3D20E बड़ी उच्च रूपांतरण/दक्षता कन्नै (त्रै स्वतंत्र संश्लेषण प्रतिक्रियाएं थमां औसत ± sem दे रूप च पेश कीते गेदे आंकड़े) (b).c, मास स्पेक्ट्रम (निचले आधा) संभोग कीती गेदी मादा एलआरटी (ऊपर आधा) च पाया जाने आह् ला ecdysone कन्नै बिल्कुल मेल खांदा ऐ (ऊपर आधा).d, 20E (0.63 μg, P = 0.02;0.21 μg, P < 0.0001; (0.63 μg, P = 0.0002; 0.21 μg, P = 0.54; Fisher’s exact test, 2-sided).e, 3D20E इंजेक्शन ने 10% इथेनॉल नियंत्रण (0.21 μg, P < 0.0001; 0.13) दी तुलना च कुंवारी मादाएं च काफी उच्च स्पॉनिंग दर प्रेरित कीती μg, P = 0.0003; उच्च खुराक (0.21 μg, पी = 0.0019; 0.13 μg, पी = 0.075; फिशर दा सटीक परीक्षण, दो-तरफा)।सभनें पैनल च, एन जैविक रूप कन्नै स्वतंत्र मच्छर नमूनें दी संख्या दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ।एनएस, महत्वपूर्ण नेईं।* पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.001.डेटा त्रै प्रतिलिपिएं थमां ऐ।
पिछले अध्ययनें च असें एह् निर्धारत कीता ऐ जे स्टेरॉयड हार्मोन दा यौन हस्तांतरण MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) दी अभिव्यक्ति गी प्रेरित करदा ऐ, जेह्ड़ा इक महिला प्रजनन जीन ऐ जेह्ड़ा ए मलेरिया-एन्डेमिक इलाकें च, असें एह् निर्धारत करने दा फैसला कीता जे कुस हार्मोन 3D20E जां 20E इस जीन दी अभिव्यक्ति गी ट्रिगर करदा ऐ ।असें पाया जे जदके 20E इंजेक्शन ने विशेश रूप कन्नै जां मते शक्तिशाली रूप कन्नै किश परमाणु हार्मोन रिसेप्टर्स (HR), जि’यां HR3 ते HR4, ते ठेठ डाउनस्ट्रीम स्टेरॉयड लक्ष्य, जि’यां yolkogenic जीन Vg14, 15, 16, MISO मता हा मजबूती कन्नै 3D20E (विस्तारित डेटा चित्र 3) द्वारा प्रेरित कीता गेआ हा।इस चाल्लीं, इस एंड्रोजेनिक स्टेरॉयड हार्मोन दा यौन स्थानांतरण ऐसे तंत्र गी प्रेरित करदा दिक्खने गी मिलदा ऐ जेह्ड़ा महिलाएं गी परजीवी संक्रमण कन्नै पैदा होने आह्ली लागत थमां बचांदा ऐ।इसदे अलावा, 3D20E ई रिसेप्टर EcR दे दोनों आइसोफॉर्में गी अंतर रूप कन्नै प्रभावित करदा ऐ, जिस कन्नै EcR-A ते दबाने गी प्रेरित करदा ऐ EcR-B, ते होर मती मजबूती कन्नै होर संभोग-प्रेरक जीन गी शुरू करना, जिंदे च HPX15 बी शामल ऐ, जेह्ड़ा महिलाएं दी प्रजनन क्षमता गी प्रभावित करदा ऐ ।एह् ईपीपी-चुपचाप नर कन्नै संभोग करने आह्ली मादाएं च दिक्खे गेदे महत्वपूर्ण बांझपन दी व्याख्या करी सकदा ऐ (विस्तारित आंकड़े चित्रा 3) ।एह् आंकड़े दो ecdysone हार्मोनें कन्नै तरजीही रूप कन्नै सक्रिय कीते गेदे डाउनस्ट्रीम रस्ते दे अस्तित्व दा सुझाऽ दिंदे न जेह्ड़े लिंग-विशिष्ट कम्मै दे अधार पर हो सकदे न
अगले, असें अपनी बायोइन्फोर्मैटिक्स पाइपलाइन च चिह्नित दो EcK जीन दे कम्मै दा परीक्षण कीता।EcK1 जां EcK2 गी चुप करने दे नतीजे च पुरुषें च मती मौत होई (विस्तारित डेटा चित्रा 4a), जिस थमां पता चलदा ऐ जे ecDysone फास्फोरिलेशन, ते इस चाल्लीं निष्क्रियता, जीवित रौह् ने आस्तै महत्वपूर्ण ऐ।किजोकी EcK2 गी EcK1 थमां उच्चे स्तर पर व्यक्त कीता गेआ हा ते MAGs च इसदा पता लाया गेआ हा प्रोटीओमिक्स (चित्र 2b,c ते पूरक तालिका 2), असें इसगी 20E कन्नै इन्क्यूबेशन करियै इसदी ecdysteroid kinase गतिविधि गी प्रमाणित कीता, जिसदे फलस्वरूप फास्फोरिलेशन 20E22P (विस्तारित डेटा चित्रा 2).4b)। 3D20E दी बजाय 20E EcK2 दा पसंदीदा लक्ष्य होई सकदा ऐ।
साढ़े आरएनए-seq विश्लेषण दे अनुसार, EcK2 कुंवारी मादाएं दे एलआरटी च बी मती मात्रा च व्यक्त कीता गेआ हा, जित्थें एह् संभोग दे बाद बंद करी दित्ता गेआ हा (चित्र 2b)।असें इनें आंकड़ें दी पुष्टि कीती ते एह् निर्धारत कीता जे EcK2 अभिव्यक्ति खून दे खिलाने कन्नै प्रभावित नेईं ऐ (विस्तारित आंकड़े चित्रा 5a)।साढ़े शुरूआती एमएस प्रयोगें गी विस्तार दिंदे होई असें निर्धारित कीता जे 20E22P दी चोटी चोटी कन्नै नेड़में रिश्ते च ऐ 20E दे (खून दे खाने दे 22-26 घैंटे बाद; विस्तारित आंकड़े चित्र 5b)।कुंवारी महिलाएं च EcK2 गी चुप करने दे नतीजे च 26 घैंटें दे बाद खून दे खाने दे बाद 20E ते 20E22P दे सापेक्ष अनुपात च 3 गुना बद्धोबद्धी होई (विस्तारित आंकड़े चित्र 2c ते 5c), जिस कन्नै इस गल्ल दी पुष्टि होई जे EcK2 बी 20E च फास्फोरलाइज करदा ऐ मादाएं।उल्लेखनीय रूप कन्नै, EcK2-क्षीण कुंवारी ने पूरी यौन ग्रहणशीलता बनाई रक्खी (विस्तारित आंकड़े चित्रा 5d,e), जिस थमां एह् होर बी सुझाऽ दित्ता जंदा ऐ जे 20E दे मादा उत्पादन कन्नै संभोग प्रतिरोधक अवधि गी प्रेरित नेईं कीता जंदा ऐ।हालांके, इनें मादाएं च नियंत्रण दी तुलना च अंडे देने दी दर च काफी बद्धोबद्ध होआ हा, जिस च 30% शा मते कुंवारी अंडे दिंदे हे (विस्तारित आंकड़े चित्रा 5f).जेकर खून खिलाने दे बाद डबल-स्ट्रैंड Eck2 आरएनए (dsEcK2) इंजेक्शन दित्ते गे तां स्पॉनिंग नेईं होई जंदी ही, जिस बिंदु पर खून दे सेवन दे कारण 20E चोटी च कमी आई ही।कुल मिलाइयै, एह् नतीजे इक माडल दा समर्थन करदे न जेह्दे कन्नै खून चूसने दे बाद पैदा होने आह्ला 20E स्पॉनिंग गी प्रेरित करी सकदा ऐ, पर तदूं गै जदूं स्पॉनिंग ब्लॉक (EcK2 ते संभवत: होर कारक) मुड़दा ऐ off by mating.न ते 20E ते न गै 3D20E इंजेक्शनें ने कुंवारी च EcK2 अभिव्यक्ति गी रोकया (विस्तारित डेटा चित्र 5g), जिस थमां पता चलदा ऐ जे होर कारक इस किनारे दे रोकथाम च मध्यस्थता करदे न।हालांके, खून च खिलाने दे बाद 20E दे स्तर संभोग दी बेचैनी पैदा करने आस्तै पर्याप्त नेईं हे, पर यौन स्थानांतरित 3D20E दे उच्च टिटर कन्नै प्रभावी ढंगै कन्नै शुरू कीते गे हे।
साढ़े नतीजे ए.गैम्बिया दी प्रजनन सफलता गी नियंत्रित करने आह्ले तंत्रें दे बारे च महत्वपूर्ण जानकारी दिंदे न ।इक माडल सामने आया ऐ जित्थें नर 3D20E दे उच्च टिटर दा संश्लेषण करने आस्तै विकसित कीते गे न , जेह्ड़ा इक नर-विशिष्ट संशोधित एकडाइसोन ऐ जेह्ड़ा मादाएं गी होर संभोग करने आस्तै असंवेदनशील बनाइयै माता-पिता गी आश्वस्त करदा ऐ ।इसदे कन्नै गै इनें मलेरिया वैक्टरें ने बी सक्रिय करने आस्तै इक कुशल प्रणाली विकसित कीती ऐ नर-विशिष्ट ईपीपी दे यौन स्थानांतरण दे जवाब च महिलाएं च 3D20E।साढ़े ज्ञान दे अनुसार, एह् कीड़े-मकोड़े च इक अनोखा ते महत्वपूर्ण कार्य करने आह्ली नर- ते मादा प्रधान स्टेरॉयड हार्मोन प्रणाली दा पैह्ला उदाहरण ऐ ।नर-विशिष्ट इक्डाइसोन फंक्शन दा प्रस्ताव कीता गेआ ऐ पर निश्चित रूप कन्नै प्रदर्शित नेईं कीता गेआ ऐ ।उदाहरण दे तौर पर, इक बड्डे पैमाने पर गलत परिकल्पना 18 ऐ जे एह् कम्में दा प्रदर्शन कीता जाई सकदा ऐ 20E पूर्ववर्ती E1.एह् सारें शा मता ज्ञात ऐ जे ड्रोसोफिला च मोनाड्री गी छोटे सेक्स पेप्टाइड्स19,20 दे यौन स्थानांतरण कन्नै शुरू कीता जंदा ऐ जेह्ड़े विशिष्ट सेक्स पेप्टाइड रिसेप्टर्स दे माध्यम कन्नै महिला प्रजनन मार्ग गी नसबंदी करने आह्ले न्यूरॉन्स कन्नै परस्पर क्रिया करदे न ते एह् निर्धारत करने आस्तै जे एह् झरना मच्छरें ते ड्रोसोफिला दे बश्कार संरक्षित कीते जाई सकदे न जां नेईं ।
साढ़े अध्ययन च चिह्नित महिलाएं दी प्रजनन क्षमता ते व्यवहार पर 3D20E दी महत्वपूर्ण भूमिका गी दिक्खदे होई, 3D20E संश्लेषण ते सक्रियकरण दे रस्ते भविष्य च मच्छर नियंत्रण रणनीतियें लेई नमें मौके पेश करदे न, जि’यां बाँझ कीड़े-मकोड़े दी तकनीक रणनीतियें च प्रतिस्पर्धी बाँझ नर दी पीढ़ी जंगली रिलीज आस्तै जां कुंवारी खेत्तर च 3D20E दी नकल करने आस्तै इस्तेमाल करो 3D20E दा नर-विशिष्ट कार्य उसलै विकसित होई सकदा ऐ जिसलै ए.गैम्बिया ते होर सेलिया प्रजातियें ने अपने वीर्य गी संभोग प्लग च जमा करने दी क्षमता हासल कीती ऐ , की जे इस कन्नै बड़ी मती संख्या च हार्मोन ते हार्मोन सक्रिय करने आह्ले एन्जाइमें दे कुशल हस्तांतरण दी अनुमति दित्ती जंदी ऐ ।बदली च 3D20E विकास जेह्ड़ा मोनाड्री गी लागू करदा ऐ , मादाएं आस्तै इक तंत्र प्रदान करदा ऐ (MISO दी उच्च अभिव्यक्ति दे माध्यम कन्नै) मलेरिया दे उच्च प्रसार दे क्षेत्रें च प्रजनन फिटनेस , जेह्ड़ी अप्रत्यक्ष रूप कन्नै प्लाज्मोडियम दे संक्रमण च योगदान करदी ऐ ।इस गल्लै गी दिक्खदे होई जे मादा 20E दे मादा एनोफिलस मच्छरें च पी. फाल्सीपेरम दे जीवित रौह् ने ते विकास उप्पर गहरा असर दिक्खेआ गेआ ऐ ,24 नर ते मादा स्टेरॉयड हार्मोन दे रस्ते हून मच्छर-पराजीवी परस्पर क्रियाएं दे मुक्ख पहलू न
ए.गैम्बिया जी 3 उपभेदें गी मानक कीड़े-मकोड़े दी स्थिति (26-28 डिग्री सेल्सियस, 65-80% सापेक्ष आर्द्रता, 12:12 घैंटें प्रकाश/काला प्रकाश अवधि) च पालन कीता गेआ हा।लार्वा गी पाउडर मच्छी दे खाने (टेट्रामिन ट्रॉपिकल फ्लेक्स, कोई गोली ते टेट्रा पोंड स्टिक 7:7:2 दे अनुपात च) कन्नै खिलाया गेआ हा।वयस्क मच्छरें गी एड लिबिटम 10% डेक्स्ट्रोज घोल ते हफ्तेवार मनुक्खी खून (अध्ययन खून दे घटक) दित्ता गेआ हा ।कुंवारी मच्छरें गी माइक्रोस्कोपी कन्नै सिरे दी जांच करने दे बाद प्यूपल स्टेज च लिंगें गी अलग करियै हासल कीता गेआ हा ।DsRed ट्रांसजीन गी लेइयै जाने आह्ले नर दा वर्णन पैह्लें कीता गेआ ऐ
मजबूर संभोग प्रयोग पैह् ले थमां वर्णत प्रोटोकॉल दे अनुसार कीते गे ।कुदरती संभोग आस्तै 4 दिनें दी कुंवारी मादाएं गी यौन रूप कन्नै परिपक्व कुंवारी नर कन्नै दो रातें तकर 1:3 अनुपात च रक्खेआ गेआ हा ।प्रयोगें आस्तै जिंदे च नर गी dsEPP दा इंजेक्शन दित्ता गेआ हा , को-केजिंग इंजेक्शन दे बाद 3-4 दिनें कन्नै मेल खांदा हा , जिसलै फास्फेटेज गतिविधि गी मती मात्रा च चुप कीता गेआ हा (Extended डेटा चित्रा 2 बी)।
मच्छर दे ऊतकें, बचे दे शव (शरीर दा बाकी हिस्सा), जां पूरे शरीर गी 100% मेथानॉल च विच्छेदन करियै बीडर (2 मिमी कांच दे मोती, 2,400 आरपीएम, 90 सेकंड) कन्नै समरूप कीता गेआ।उतक दी मात्रा ते मेथानॉल दी मात्रा इस चाल्ली ही: बाकी शरीर, 1,000 μl च 50 मैग, 50-100 80 μl ऐ; महिला एलआरटी, 25–50 80 μl.अवक्षेप गी मेथानॉल दे उस्सै मात्रा कन्नै इक दुए मेथानॉल निष्कर्षण दे अधीन कीता गेआ।कोशिका मलबे गी सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै हटाया गेआ।दोनें निष्कर्षें थमां मेथानॉल गी इकट्ठा करियै नाइट्रोजन प्रवाह दे हेठ सुक्खेआ गेआ, फिर पानी च 80% मेथानॉल दे निम्नलिखित मात्रा च फिरी लटकाया गेआ: शरीर दा बाकी हिस्सा, 50 μl ऐ; एमएजी ते महिला एलआरटी, 30 μl।
नमूनें दा विश्लेषण इक एलसी उपकरण (वैंक्विश, थर्मो फिशर) कन्नै जुड़े दे मास स्पेक्ट्रोमीटर (आईडी-एक्स, थर्मो फिशर) पर कीता गेआ।5 μl नमूने गी 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गेदे 3 माइक्रोन, 100 × 4.6 मिमी स्तंभ (इंस्पायर सी8, डिकमा) पर इंजेक्ट कीता गेआ।एलसी आस्तै मोबाइल चरण ए (पानी, 0.1%) हे। फार्मिक एसिड) ते बी (एसीटोनिट्राइल, 0.1% फार्मिक एसिड)।एलसी ढाल इस चाल्ली हा: 1 मिनट लेई 5% बी, फिर 11 मिनट च 100% बी तगर बधी गेआ।100% पर 8 मिनट दे बाद, 4 मिनट लेई 5% बी पर स्तंभ गी फिरी संतुलित करो।प्रवाह दर 0.3 मिलीलीटर मिन-1.एमएस स्रोत च आयनीकरण ऐ सकारात्मक ते नकारात्मक मोड च गरम इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण कन्नै पूरा कीता जंदा ऐ।
मास स्पेक्ट्रोमीटर पूर्ण एमएस मोड च 60,000 रिजोल्यूशन पर 350 थमां 680 तगर m/z रेंज च डेटा गी मापदा ऐ।MS/MS डेटा गी [M + H]+ (सभनें लक्ष्य), [M - H2O + H]+ (सभनें लक्ष्य), ते [M - H]- (फॉस्फोरिलेशन लक्ष्य) पर हासल कीता गेआ हा।MS/MS डेटा दा इस्तेमाल लक्ष्यें दे ecdysone गुणें दी पुष्टि करने लेई कीता गेआ हा उपलब्ध हा।गैर-लक्षित इकडीस्टेरॉइड दी पन्छान करने आस्तै, >15% सापेक्ष प्रचुरता आह् ले सब्भै एचपीएलसी चोटियें आस्तै एमएस/एमएस डेटा दा विश्लेषण कीता गेआ।एक पुरुष च पाई गेदी मात्रा कन्नै उंदी समतुल्यता दी गणना करने आस्तै इक विशिष्ट नमूने (20E, 3D20E) थमां बनाई गेदी मानक वक्रताएं (20E, 3D20E) थमां बनाई गेदी मानक वक्रताएं दा उपयोग करियै मात्रा निर्धारत करो 3D20E, मात्रा निर्धारण निम्नलिखित एड्यूक्टें दे योग दा उपयोग करदे होई कीता गेआ: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.डेटा कड्ढेआ गेआ ते ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.1) दा उपयोग करियै मात्रा निर्धारत कीती गेई।एमएस/एमएस डेटा दा विश्लेषण Xcalibur (संस्करण 4.4) दा उपयोग करियै कीता गेआ।ई, 20E दे एमएस स्पेक्ट्रा ते 3D20E दी तुलना संबंधित मानकें कन्नै कीती गेई।3D20E22P दा विश्लेषण गिरार्ड दे अभिकर्मक कन्नै व्युत्पन्नीकरण करियै कीता गेआ।20E22P दा विश्लेषण m/z अनुपात कन्नै कीता गेआ।
3D20E22P गी MAG थमां शुद्ध कीता गेआ हा।शुद्धिकरण गी एचपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण दे समान एलसी परिस्थितियें च इक अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (एक्विटी, वाटर्स) दा उपयोग करियै विश्लेषणात्मक पैमाने पर कीता गेआ हा पैह् ले निर्धारत कीते गेदे समें च गै पता लाया गेआ हा।इसदे बाद कड्ढे गेदे यौगिकें दी शुद्धता दी जांच एचपीएलसी-एमएस/एमएस कन्नै कीती गेई जि’यां उप्पर दित्ते गेदे न।
निर्माता दे निर्देशें दे बाद TRI अभिकर्मक (थर्मो फिशर) दा उपयोग करियै कुल आरएनए गी 10-12 प्रजनन ऊतकें जां शरीर दे होर हिस्सें (सिरहीन) थमां कड्ढेआ गेआ हा।आरएनए गी TURBO DNase (Thermo Fisher) कन्नै इलाज कीता गेआ हा।cDNA गी इसदे बाद मोलोनी मूरीन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (M-MLV RT; Thermo Fisher) दा उपयोग करियै संश्लेषित कीता गेआ हा निर्माता दे निर्देशें च।रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पीसीआर (RT-qPCR; विस्तारित डेटा तालिका 2) आस्तै प्राइमर पैह् ले थमां गै प्रकाशत कीते गेदे हे24 जां प्राइमर-BLAST26 दा उपयोग करियै डिजाइन कीते गेदे हे, जिस च 70-150 बीपी आकार च ते एक्सोन-एक्सन जंक्शनें च फैले दे उत्पादें गी प्राथमिकता दित्ती गेई ही जां प्राइमर जोड़ी प्राइमर त्रै थमां चार जैविक प्रतिकृतियें थमां बक्ख-बक्ख एक्सोन।cDNA नमूनें आरटी-क्यूपीसीआर लेई पानी च चार गुना पतला कीता गेआ हा।मात्रा निर्धारण 15 μl प्रतिकृति प्रतिक्रियाएं च कीता गेआ हा जिंदे च 1× पावरअप एसवाईबीआर ग्रीन मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर), प्राइमरे, ते 5 μl पतला सीडीएनए शामल हा।रिएक्शनें गी क्वांटस्टूडियो 6 प्रो रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर) पर चलाया गेआ हा ते डिजाइन ते... विश्लेषण (संस्करण 2.4.3).जि’यां इस अध्ययन च दस्सेआ गेआ ऐ जे सापेक्ष मात्रा गी राइबोसोमल जीन RpL19 (AGAP004422) च सामान्य कीता गेआ हा, जिसदी अभिव्यक्ति च खून दे खिलाने 27 जां संभोग 3 कन्नै मता बदलाव नेईं आया।
आरएनए दी गुणवत्ता दी जांच एजिलेंट बायोएनालाइजर 2100 बायोएनालाइजर (एजिलेंट) दा उपयोग करदे होई कीती गेई ही।इलुमिना जोड़ीदार-अंत लाइब्रेरी गी एमआईटी ते हार्वर्ड दे ब्रॉड इंस्टीट्यूट च तैयार कीता गेआ ते चलाया गेआ।सीक्वेंसिंग रीड्स गी डिफ़ॉल्ट पैरामीटर कन्नै HISAT2 (संस्करण 2.0.5) दा उपयोग करियै ए (MAPQ) स्कोर <30 गी Samtools (संस्करण 1.3.1) दा उपयोग करियै हटाया गेआ हा।जीनें च मैप कीते गेदे रीड्स दी संख्या गी डिफ़ॉल्ट पैरामीटर कन्नै htseq-count (संस्करण 0.9.1) दा उपयोग करियै गिनेआ गेआ हा।सामान्य रीड गिनती दी गणना कीती गेई ते आर (संस्करण 4.0.3) च DESeq2 पैकेज (संस्करण 1.28.1) दा उपयोग करियै विभेदक जीन अभिव्यक्ति दा विश्लेषण कीता गेआ।
एक्डीसोन-संशोधक जीन उम्मीदवारें दी पन्छान पैह् ले थमां गै पीएसआई-ब्लास्ट एल्गोरिथ्म (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) दा उपयोग करियै ए. एनपी_001038956.1), मुस्का डोमेस्टिका (एक्सेस नंबर एक्सपी_005182020.1, एक्सपी_005175332.1 ते एक्सपी_011294434.1) ते माइक्रोप्लाटिस डिमोलिटर (एक्सेस नंबर एक्सपी_00852646.1 ते एक्सपी_008552645.1)। बी मोरी (अभिसरण संख्या एनपी_001036900), ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (अभिसरण संख्या एनपी_651202), एपिस मेलिफेरा (अभिसरण संख्या एक्सपी_394838) ते एसीर्थोसिफोन पिसम (अभिसरण संख्या एक्सपी_001947166) थमां ईसीके; ते बी मोरी (एक्सेस नंबर एक्सपी_001947166) एनपी_001177919.1 ते एनपी_001243996.1) ते डी. मेलानोगास्टर (एक्सेस नंबर एनपी_572986.1) दे ईओ (चरण 1) थमां ईपीपी।अगले, उच्च mRNA अभिव्यक्ति (>100) दे आधार उप्पर फिल्टर हिट गांबिया च प्रजनन ऊतक (महिला एलआरटी जां एमएजी) च टुकड़े/किलोबेस एक्सोन प्रति मिलियन मैप कीते गेदे रीड्स (FPKM) जां >85%) (चरण 2) । विशिष्टता च सुधार आस्तै, असें उम्मीदवार एन्जाइमें दा चयन कीता जेह्ड़े ए.अल्बिमैनस दे प्रजनन ऊतक च बी अभिव्यक्त होंदे न, जेह्ड़ी इक एनोफिलिस प्रजाति ऐ जेह्ड़ी संभोग दे दौरान इकडाइसोन दा संश्लेषण जां स्थानांतरण नेईं करदी ऐ।उम्मीदवार जीन गी ए.अल्बिमैनस प्रजनन ऊतक (चरण 3) च कम अभिव्यक्ति (<100 FPKM जां <85th percentile) दे आधार उप्पर छानने दा कम्म कीता गेआ हा (चरण 3)।As a final filter (step 4), उम्मीदवार जीन गी निम्नलिखित च घट्ट शा घट्ट इक गी संतुष्ट करने दी लोड़ ऐ : (1) विभेदक रूप कन्नै अभिव्यक्त जीन दे विश्लेषण दे अनुसार संभोग दे बाद काफी अप-रेगुलेट (P < 0.05) ते (2) गैर-प्रजनन ऊतकें च (< 85 % जां <100 FPKM)
अस पूरे-जीव समस्थानिक लेबलिंग हासल करने आस्तै पैह् ले थमां वर्णत तरीके 28,29,30 च संशोधन कीता।संक्षेप च, जंगली किस्म दे सैकरोमाइसिस सेरेविसिया टाइप II (YSC2, सिग्मा) दा परीक्षण खमीर नाइट्रोजन बेस (बीडी डिफको, डीएफ0335) च कीता गेआ हा जिस च (wt/vol) 2% ग्लूकोज (G7528, सिग्मा), 1.7% हा। अमीनो एसिड मुक्त ते अमोनियम सल्फेट। कल्चर मीडियम) ते 5% 15N अमोनियम सल्फेट (NLM-713, >99%, कैम्ब्रिज आइसोटोप लैबोरेटरीज) नाइट्रोजन दे इकमात्र स्रोत दे रूप च।खमीर गी सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै बरामद कीता गेआ हा ते मच्छर दे लार्वा गी प्यूपेशन तगर एड लिबिटम खिलाया गेआ हा।चौथे इंस्टार गी रोकने आस्तै मच्छी दे आटे (0.5 मिलिग्राम प्रति 300 लार्वा) कन्नै पूरक मृत्यु दर।इसदे बाद संभोग दे दौरान स्थानांतरित नर प्रोटीओम दा विश्लेषण करने आस्तै बिना लेबल आह्ले नर कन्नै संभोग प्रयोगें च सिर्फ मादाएं दा इस्तेमाल कीता गेआ।
4-6 दिनें दी 15N-टैग कीती गेदी कुंवारी मादाएं गी उम्र कन्नै मेल खंदा बिना टैग कीते गेदे कुंवारी नर कन्नै संभोग करने लेई मजबूर कीता गेआ हा।एपिफ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी दे हेठ संभोग प्लग दा पता लाने कन्नै सफल संभोग दी सत्यापन कीती गेई।3, 12, ते 24 एचपीएम पर, 45-55 संभोग कीती गेदी मादाएं दे अलिंद गी 50 μl अमोनियम च विच्छेदित कीता गेआ बाइकार्बोनेट बफर (पीएच 7.8) ते मूसल कन्नै होमोजीनाइज कीता गेआ।होमोजीनेट गी सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ ते सुपरनेटेंट गी 50 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट च 50 μl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) कन्नै मिलाया गेआ।हर नमूने थमां सुपरनेटेंट ते गोली गी सूखी बर्फ पर स्नैप फ्रीज कीता गेआ ते रातीं-रात भर भेजेआ गेआ वाशिंगटन विश्वविद्यालय च मैककोस प्रयोगशाला, जित्थें एलसी-एमएस/एमएस आस्तै नमूने दी तैयारी पूरी होई गेई ही।गोली गी 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट च 50 μl 0.1% RapiGest च फिरी निलंबित करो ते पानी दे स्नान च सोनिकेट करो।गोली ते सुपरनेटेंट दी प्रोटीन सांद्रता गी बीसीए परीक्षण कन्नै मापा गेआ, नमूनें गी 5 एमएम डिथियोथ्रेइटोल कन्नै घट्ट कीता गेआ (डीटीटी; सिग्मा), 15 मिमी आयोडोएसीटामाइड (सिग्मा) कन्नै अल्काइल कीता गेआ ते 37 डिग्री सेल्सियस (1:0 50) पर 1 घैंटे तगर ट्रिप्सिनीकरण: ट्रिप्सिन:सबस्ट्रेट अनुपात कन्नै इन्क्यूब कीता गेआ।RapiGest गी 200 mM HCl दे जोड़े जाने कन्नै लाइस कीता गेआ, जिसदे बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट तगर इन्क्यूबेशन कीता गेआ ते सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ मलबे गी हटाने आस्तै 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तगर 14,000 आरपीएम।नमूनें गी दोहरी-मोड ठोस-चरण निष्कर्षण (ओएसिस एमसीएक्स कारतूस, वाटर्स) कन्नै धोया गेआ ते 0.1% फार्मिक एसिड च 0.33 μg μl-1 दी अंतिम प्रोटीन सांद्रता आस्तै फिरी लटकाया गेआ।अनलेबल MAG प्रोटीओम दा कुंवारी थमां इसी चाल्लीं विश्लेषण कीता गेआ males.हर नमूने आस्तै दो विश्लेषणात्मक प्रतिकृतियें दा विश्लेषण कीता गेआ।अगले, बृहस्पति C12 रिवर्स-फेज राल (Phenomenex) ते 180 मिनट दी तरल क्रोमैटोग्राफी कन्नै पैक कीते गेदे 4-सेमी फ्यूज्ड सिलिका Kasil1 (PQ) फ्रिट ट्रैप कन्नै 25-सेमी फ्यूज्ड सिलिका 75-μm स्तंभ दा उपयोग करियै हर इक दे 1 μg दा विश्लेषण कीता गेआ। नमूना डाइजेस्ट – एमएस/एमएस गी नैनोएसीक्यूटी यूपीएलसी सिस्टम (वाटर्स) कन्नै क्यू-एक्सक्टिव एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर) पर चलाया गेआ हा।हर रन आस्तै पैदा कीते गेदे डेटा कन्नै सरबंधत अधिग्रहण डेटा गी प्रोटीओविज़ार्ड (संस्करण 3.0.20287) दा उपयोग करियै ते प्रोटीन युक्त FASTA डेटाबेस दे खिलाफ Comet31 (संस्करण 3.2) दा उपयोग करियै mzML प्रारूप च बदलेआ गेआ हा एनोफिलीज गैम्बिया (वेक्टरबेस संस्करण 54), एनोफिलीज कोलुज़ी थमां अनुक्रम माली-एनआईएच (वेक्टरबेस संस्करण 54), सैकरोमाइसिस सेरेविसिया (यूनिप्रोट, मार्च 2021), ए गैम्बिया आरएनए-सेक, ते ज्ञात मनुक्खी दूषित पदार्थें दे त्रै-फ्रेम अनुवादें पर इक खोज कीती गेई।पेप्टाइड मैप-मैच एफडीआर दा उपयोग करियै निर्धारत कीता गेआ 0.01 दी थ्रेशोल्ड कन्नै परकोलेटर32 (संस्करण 3.05), ते पेप्टाइड्स गी लाइमलाइट33 (संस्करण 2.2.0) च प्रोटीन पारसिमोनी दा उपयोग करियै प्रोटीन पन्छान च इकट्ठा कीता गेआ हा।सापेक्ष प्रोटीन प्रचुरता दा अनुमान हर रन च हर प्रोटीन आस्तै गणना कीते गेदे सामान्यीकृत स्पेक्ट्रल प्रचुरता कारक (NSAF) दा उपयोग करियै कीता गेआ हा जि’यां पैह् ले वर्णत कीता गेआ हा।हर प्रोटीन दे सापेक्ष एनएसएएफ गी दो बक्ख-बक्ख जैविक थमां नमूनें दे पार औसत कीता गेआ हा replicates.15N लेबलिंग ने महिला प्रोटीओम गी सफलतापूर्वक मास्क कीता, हालांकि लेबल कीते गेदे कुंवारीएं थमां बिना लेबल प्रोटीन दी थोड़ी मात्रा दा पता लाया जाई सकदा हा।असें मादा कच्चे नमूनें च पुरुष प्रोटीन दी कमी (1-5 स्पेक्ट्रा) दा पता सिर्फ तकनीकी रनें च दर्ज कीता, जित्थें कच्चे नमूनें गी नर/संभोग नमूनें दे बाद चलाया गेआ हा, जिसदे नतीजे च एचपीएलसी "कैरी ओवर" होंदा हा लेबल कुंवारीएं थमां ‘दूषित पदार्थ’ गी पूरक तालिका 1 च दित्ता गेआ ऐ ।
जेनस्क्रिप्ट च दो एंटीजेनिक पेप्टाइड्स, QTTDRVAPAPDQQQ (आइसोटाइप पीए दे अंदर) ते MESDGTTPSGDSEQ (आइसोटाइप पीए ते पीबी दे अंदर) गी इकट्ठा कीता गेआ, फिर वाहक प्रोटीन केएलएच कन्नै संयुग्मित कीता गेआ ते न्यूजीलैंड दे खरगोशें च इंजेक्शन दित्ता गेआ।खरगोशें गी चौथे इंजेक्शन दे बाद बलिदान दित्ता गेआ, ते कुल आईजीजी गी आत्मीयता कन्नै अलग कीता गेआ शुद्धिकरण।सबसे ईपीपी-विशिष्ट खरगोश थमां आईजीजी दा इस्तेमाल होर वेस्टर्न ब्लॉटिंग लेई कीता गेआ।
वेस्टर्न ब्लॉटें लेई, 4 दिनें दे कुंवारी नर ते कुंवारी जां जबरदस्ती संभोग कीती गेदी मादाएं (<10 संभोग दे बाद) थमां एमएजी (n = 10, जित्थें n जैविक रूप कन्नै स्वतंत्र मच्छरें दे नमूनें दी संख्या दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ) ते मादा एलआरटी (n = 30) थमां (<10 संभोग दे बाद), प्रोटीन निष्कर्षण बफर (50 एमएम ट्राइस, पीएच 8.0; 1% एनपी-40; 0.25%)। सोडियम डिऑक्सीकोलेट;150 मिमी NaCl;1 मिमी ईडीटीए; °C.प्रोटीन दी मात्रा ब्रैडफोर्ड परीक्षण (बायो-रैड) कन्नै कीती गेई।फिर, 20 μg MAG प्रोटीन, 40 μg LRT प्रोटीन, ते 20 μg अवशिष्ट बल्क प्रोटीन गी विकृत कीता गेआ ते MOPS बफर दा इस्तेमाल करियै 10% Bis-Tris NuPAGE कन्नै बक्ख कीता गेआ।प्रोटीन गी iBlot2 स्थानांतरण दा उपयोग करियै पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड झिल्ली च स्थानांतरित कीता गेआ सिस्टम (थर्मो फिशर)।झिल्लीएं गी 1× पीबीएस-टी (पीबीएस च 0.1% ट्वीन-20) च दो बारी धोया गेआ ते फिर ओडिसी ब्लॉकिंग बफर (ली-कोर) च 1 घैंटें तगर 22 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक कीता गेआ।झिल्ली गी कस्टम खरगोश एंटी-ईपीपी पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (ब्लॉकिंग बफर च 1:700) ते खरगोश कन्नै 4 डिग्री सेल्सियस पर रातीं-रात हिलाया गेआ एंटी-एक्टिन मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी MAC237 (Abeam; 1:4,000)।झिल्ली गी पीबीएस-टी कन्नै धोया गेआ ते फिर सेकेंडरी एंटीबॉडी (गधे एंटी-खरगोश 800CW ते बकरी एंटी-चूहा 680LT (Li-Cor), दोनों 1:20,000) कन्नै 0.01% एसडीएस ते 0.2% युक्त ब्लॉकिंग बफर च इन्क्यूब कीता गेआ। 22 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटे तगर -20 गी ट्वीन कीता गेआ।झिल्लीं गी पीबीएस-टी कन्नै धोया गेआ ते ओडिसी सीएलएक्स स्कैनर कन्नै इमेजिंग कीती गेई।इमेज स्टूडियो (संस्करण 5.2) च छवियें गी इकट्ठा करियै संसाधित कीता गेआ।ईपीपी-आरए आइसोफॉर्म (82 केडीए) दे अनुरूप इक विशिष्ट बैंड दा पता नेईं लग्गा।
ईपीपी (हिस्टिडीन फास्फेटेज डोमेन, एनसीबीआई संरक्षित डोमेन खोज 34 युक्त आइसोफॉर्म एजीएपी002463-आरबी दे रूप च) ते EcK2 (AGAP002181) दे कोडिंग क्षेत्रें गी pET-21a(+) प्लाज्मिड (Novagen Millipore Sigma) च क्लोन कीता गेआ ; प्राइमरे विस्तारित डेटा तालिका 2. अट्ठ GS4 लिंकर (टैंडम च) pET-21a(+)-EcK2 निर्माण दे C-टर्मिनल 6xHis टैग थमां पैह् ले दाखल कीते गे हे।पुनर्संयोजन प्रोटीन NEBExpress कोशिका-मुक्त ई. कोलाई प्रोटीन संश्लेषण रिएक्शन (न्यू इंग्लैंड बायोलैब) दा उपयोग करदे होई पैदा कीते गे हे।पुनर्संयोजन प्रोटीन गी NEBExpress Ni स्पिन कॉलम दा उपयोग करियै शुद्ध कीता गेआ हा (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स)।डाइहाइड्रोफोलेट रिडक्टेज (DHFR) नियंत्रण प्रोटीन दा उत्पादन एनईबीएक्सप्रेस सेल-फ्री ई. कोलाई प्रोटीन संश्लेषण किट थमां डीएनए टेम्पलेट दा उपयोग करियै कीता गेआ हा।प्रोटीन गी पीबीएस च 50% ग्लिसरॉल च -20 डिग्री सेल्सियस पर 3 म्हीने तगर संग्रहीत कीता गेआ हा।
ईपीपी ते ऊतक अर्क दी फास्फेटेज गतिविधि गी 4-नाइट्रोफिनाइल फास्फेट (पीएनपीपी; सिग्मा-एल्ड्रिच) दा उपयोग करियै मापा गेआ हा।रिएक्शन बफर च 25 मिमी ट्राइस, 50 मिमी एसिटिक एसिड, 25 मिमी बिस-ट्राइस, 150 मिमी NaCl, 0.1 मिमी ईडीटीए, ते 1 मिमी डीटीटी हा।रिएक्शन बफर च ऊतक गी होमोजीन कीता गेआ ते कोशिका मलबे गी सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै हटाया गेआ हा।2.5 मिलीग्राम एमएल-1 पीएनपीपी युक्त रिएक्शन बफर च एन्जाइम जां टिशू अर्क गी मिलाइयै रिएक्शन शुरू कीता गेआ हा।रिएक्शन मिश्रण गी कमरे दे तापमान पर न्हेरे च इन्क्यूब कीता गेआ हा, ते पीएनपीपी थमां बदले गेदे पीएनपी दी मात्रा गी बक्ख-बक्ख समें पर 405 एनएम पर अवशोषण गी मापने कन्नै मात्रा निर्धारत कीती गेई ही।
इन विट्रो EcK गतिविधि आस्तै, प्रोटीन गी 200 μl बफर (pH 7.5) च 0.2 mg 20E जां 3D20E कन्नै 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ते 10 mM MgCl2 कन्नै 27 डिग्री सेल्सियस पर 2 घैंटें तगर इन्क्यूब कीता गेआ हा μl मेथानॉल, फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटे तगर ठंडा कीता गेआ, फिर 20,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ।इसदे बाद सुपरनेटेंट दा विश्लेषण एचपीएलसी-एमएस/एमएस कन्नै कीता गेआ।नियंत्रण समूह च इस्तेमाल कीते गेदे प्रोटीनें गी गर्मी-निष्क्रिय करने आस्तै, प्रोटीनें गी पीबीएस च 50% ग्लिसरॉल च 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिंट तगर इन्क्यूब कीता गेआ।
इन विट्रो ईपीपी गतिविधि आस्तै, प्रोटीन गी 3D20E22P (18 जोड़े एमएजी च पाई गेदी मात्रा दे बराबर, एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा शुद्ध कीता गेआ) कन्नै 100 μl बफर (पीएच 7.5) च 25 मिमी ट्राइस, 50 मिमी एसिटिक एसिड, 25 मिमी बिस-ट्राइस, 150 एमएम NaCl, 0.1 mM EDTA, ते 1 mM DTT 27 °C पर 3 घैंटे तगर।रिएक्शन गी 400 μl मिथानल मिलाइयै बंद कीता गेआ ते -20 °C पर 1 घैंटे तगर ठंडा कीता गेआ, फिर 20,000 g पर 4 °C पर 10 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ।सुपरनेटेंट दा विश्लेषण एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा कीता गेआ।
ईपीपी (362 बीपी), ईसीके1 (एजीएपी004574, 365 बीपी) ते ईसीके2 (556 बीपी) आस्तै पीसीआर टुकड़े गी मिश्रित-लिंग दे सिरहीन मच्छर लाशें थमां तैयार कीते गेदे सीडीएनए थमां प्रवर्धित कीता गेआ हा।ईजीएफपी नियंत्रण (495 बीपी) दे पीसीआर टुकड़े गी पैह् ले थमां वर्णत pCR2.1-eGFP थमां प्रवर्धित कीता गेआ हा; पीसीआर प्राइमरे गी विस्तारित डेटा तालिका 2 च दित्ता गेआ ऐ।पीसीआर टुकड़े गी pL4440 प्लाज्मिड पर उल्टे T7 प्रोमोटरें दे बश्कार पाया गेआ हा।प्लाज्मिड निर्माण गी NEB 5-α सक्षम ई. कोलाई (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) थमां बरामद कीता गेआ हा ते इस्तेमाल थमां पैह् ले डीएनए अनुक्रमण कन्नै सत्यापन कीता गेआ हा (इंसर्ट अनुक्रम आस्तै पूरक डेटा 1 दिक्खो)।प्राइमर T7 प्रमोटर कन्नै मेल खांदे हे (विस्तारित डेटा तालिका 2) दा इस्तेमाल pL4440 आह् ले प्लाज्मिड थमां इन्सर्ट गी प्रवर्धित करने लेई कीता गेआ हा।पीसीआर उत्पाद आकार दी पुष्टि अगरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस कन्नै कीती गेई ही।dsRNA गी मेगास्क्रिप्ट T7 ट्रांसक्रप्शन किट (थर्मो फिशर) दा उपयोग करियै पीसीआर टेम्पलेट थमां ट्रांसक्रिप्ट कीता गेआ हा ते निर्माता दे निर्देशें दे अनुसार पैह् ले वर्णत संशोधनें कन्नै शुद्ध कीता गेआ हा।
dsRNA इंजेक्शन आस्तै, 1,380 एनजी dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) गी वयस्क पुरुषें जां मादाएं (Nanoject III, Drummond) दे थैरेक्स च 10 एनजी nl-1 दी सांद्रता च इक्लोजन दे बाद 1 दिन दे अंदर इंजेक्शन दित्ता गेआ हा।जीन नॉक डाउन दे स्तर गी आरएनए द्वारा घट्ट शा घट्ट त्रै जैविक प्रतिलिपिएं च निर्धारत कीता गेआ हा निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, ते आरटी-क्यूपीसीआर।एक्डीसोन इंजेक्शन आस्तै, 4 दिनें दी कुंवारी जां 6 दिनें दी कुंवारी खून कन्नै खिलाया गेआ मादाएं गी 1.3, 2.1, दी सांद्रता च 0.13, 0.21, जां 0.63 μg 20E जां 3D20E (Nanoject III, Drummond) दा इंजेक्शन दित्ता गेआ हा। क्रमशः, प्रयोगात्मक डिजाइन दे आधार उप्पर जां 6.3 एनजी एनएल-1.पानी च 100 एनएल 10% (vol/vol) इथानॉल इंजेक्ट करो; 100 एनएल 3D20E22P 10% इथानॉल च (मैजी दी इक जोड़ी च पाई जाने आह् ली मात्रा दे 75% दे बराबर) ।मच्छरें गी बेतरतीब ढंगै कन्नै इंजेक्शन समूह च नियुक्त कीता गेआ।
स्पॉनिंग परीक्षणें लेई 3 दिनें दी मादाएं गी मनुक्खी खून पर एड लिबिटम खिलाया गेआ हा ।आंशिक रूप कन्नै खिलाया गेआ जां नेईं खिलाया गेआ मच्छरें गी कड्ढी लैना संभोग कीती गेदी मादाएं आस्तै, जेह्ड़े अंडे लार्वा च फट्टदे हे, उ’नेंगी उपजाऊ मन्नेआ जंदा हा।
संभोग परीक्षणें लेई, मादाएं गी संभोग दे प्रतिरोधक क्षमता विकसित करने आस्तै इलाज दे आधार उप्पर घट्ट शा घट्ट 2 दिनें दी अनुमति दित्ती गेई ही, ते जंगली किस्म दे उम्र कन्नै मेल खाने आह्ले नर गी बाद च इक गै पिंजरे च पेश कीता गेआ हा।दो रातें बाद, मादा निषेचित पुटिकाएं दा विच्छेदन कीता गेआ ते जीनोमिक डीएनए गी फ्रीज-पिघलने ते 10 मिमी ट्राइस-एचसीएल, 1000 युक्त बफर च सोनिकेशन कन्नै जारी कीता गेआ। 1 mM EDTA, ते 25 mM NaCl (pH 8.2)।नमूनें गी प्रोटीन के (0.86 μg μl-1) कन्नै 55 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तगर, उसदे बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ।कच्चे जीनोमिक डीएनए तैयारियें गी 10 गुना पतला कीता गेआ ते वाई गुणसूत्र अनुक्रमें दा qPCR पता लाया गेआ; प्राइमरे विस्तारित डेटा तालिका 2.वाई गुणसूत्र अनुक्रम दी गैर मौजूदगी संभोग नेईं होने दा संकेत दिंदा ऐ ।
पुन: संभोग परीक्षणें लेई, संभोग दी स्थिति दी पुष्टि करने आस्तै जबरन संभोग करने आह् ली मादाएं दी संभोग प्लग दी मौजूदगी दी जांच कीती गेई ते नर दी गैरहाजिरी च संभोग करने आस्तै प्रतिरोधक क्षमता विकसित करने आस्तै 2 दिनें दी अनुमति दित्ती गेई, जि’यां पैह्लें वर्णत कीता गेआ ऐ 36 .DsRed ट्रांसजेनिक शुक्राणुएं गी लेइयै जाने आह्ले नर गी उसदे बाद मादा पिंजरे च पेश कीता गेआ।दो रातें बाद, निषेचन पुटिकाएं गी पेश कीता गेआ मादाएं थमां विच्छेदन कीता गेआ, ते जीनोमिक डीएनए गी उप्पर दित्ते गेदे तरीके कन्नै तैयार कीता गेआ ते DsRed ट्रांसजीन दा qPCR पता लाया गेआ; प्राइमरे विस्तारित डेटा तालिका 2.DsRed ट्रांसजीन दी गैर मौजूदगी ने संकेत दित्ता जे कोई पुनर्संभोग नेईं होआ।
3D20E गी पैह् ले वर्णत तरीके कन्नै संश्लेषित कीता गेआ हा 37 .संक्षेप च, 10 मिलीग्राम 20E (सिग्मा-एल्ड्रिच) गी 10 मिलीलीटर पानी च घोलया गेआ, जिसदे बाद 30 मिलीग्राम प्लैटिनम ब्लैक (पाउडर दे रूप च, सिग्मा-एल्ड्रिच) गी मिलाया गेआ।O2 दी इक कोमल धारा गी लगातार रिएक्शन मिश्रण च बुलबुला कीता गेआ, जिसगी कमरे च हिलाया गेआ तापमान।6 घैंटे दे बाद, रिएक्शन गी रोकने आस्तै 30 एमएल मेथानॉल जोड़ेआ गेआ।उत्प्रेरक कणें गी हटाने आस्तै मिश्रण गी सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ।सुपरनेटेंट गी कमरे दे तापमान पर वैक्यूम च सूखने तकर वाष्पित कीता गेआ।सुक्के रिएक्शन उत्पाद गी एचपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण आस्तै इंजेक्शन आस्तै 10% इथानॉल ते मिथानॉल च घोल दित्ता गेआ।रूपांतरण दर (20E थमां 3D20E) लगभग 97% (चित्र 4 बी) हा, ते संश्लेषित 3D20E दा एमएस स्पेक्ट्रम उस कन्नै मेल खांदा हा जेह् ड़ा संभोग कीती गेदी मादाएं च पाया जंदा हा (चित्र 4c)।
किंवदंती च कीते गेदे सांख्यिक परीक्षणें दा विशिष्ट ब्यौरा दित्ता गेआ ऐ।ग्राफपैड (संस्करण 9.0) दा इस्तेमाल फिशर दी सटीक परीक्षण, मंटेल-कॉक्स परीक्षण, ते स्टूडेंट दी टी-टेस्ट करने लेई कीता गेआ हा।कोकरन-मैंटेल-हेनज़ेल परीक्षणें गी इक कस्टम आर स्क्रिप्ट (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test पर उपलब्ध) दा उपयोग करियै कीता गेआ हा।डेटा वितरण आस्तै परीक्षण कीता गेआ हा 0.05 दी महत्व दी सीमा कन्नै शापिरो-विल्क परीक्षण दा उपयोग करदे होई सामान्यता।जदूं डेटा सामान्यता परीक्षण च असफल होई गेआ तां मान-व्हिटनी परीक्षण कीता गेआ।जीवित होने आह् ले डेटा दा विश्लेषण Mantel-Cox परीक्षण दा उपयोग करियै कीता गेआ।आरएनए-seq जीन-स्तरीय अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण करने लेई DESeq2 पैकेज (संस्करण 1.28.1) दा इस्तेमाल कीता गेआ।ग्राफ पर क्षैतिज पट्टी मीडियन दा प्रतिनिधित्व करदी ऐ।ए सारे परीक्षणें लेई थ्रेशोल्ड दे रूप च P = 0.05 दा महत्व मूल्य इस्तेमाल कीता गेआ।
अध्ययन दे डिजाइन दे बारे च होर मती जानकारी आस्तै इस लेख कन्नै जुड़े दे नेचर रिसर्च रिपोर्ट दा सार दिक्खो ।
एमएस प्रोटीओमिक डेटा गी डाटासेट पन्छानने आह् ले पीएक्सडी
आरएनए-सेक डाटासेट गी सीरियल रिकार्ड GSE198665 दे अंतर्गत जीन एक्सप्रेशन कम्प्रीहेंसिव लाइब्रेरी (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) च जमा कीता गेआ ऐ।
मौजूदा अध्ययन दौरान पैदा कीते गेदे ते/जां विश्लेषण कीते गेदे अतिरिक्त डाटासेट गी उचित अनुरोध पर संबंधित लेखकें थमां हासल कीता जाई सकदा ऐ।एह् लेख स्रोत डेटा उपलब्ध करोआंदा ऐ।
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