कोशिकाएं दे डिब्बे च बंड ते होमियोस्टेसिस गी बनाए रखने आस्तै स्रावी मार्ग च प्रोटीन दी छंटाई जरूरी ऐ । शैल-मध्यस्थ छंटाई दे अलावा, स्रावी परिवहन दी प्रक्रिया च किनेसिन छंटाई च लिपिड दी भूमिका इक लम्मी बुनियादी सवाल ऐ जिसदा अजें तगर जवाब नेईं दित्ता गेआ ऐ। इत्थें, अस विवो च साबित करने आस्तै 3D इक साथ बहुरंगी उच्च रिजोल्यूशन रियल-टाइम इमेजिंग करदे आं जे नमें संश्लेषित ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-इमोबिलाइज्ड प्रोटीनें गी बड्डे पैमाने पर सेरामाइड लिपिड अंशें कन्नै क्लस्टर कीता जंदा ऐ ते विशेश एंडोप्लाज्म नेट निकास साइट च वर्गीकृत कीता जंदा ऐ, जेह् ड़ा ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीनें आसेआ इस्तेमाल कीते जाने आह् ले थमां बक्ख ऐ। इसदे अलावा, अस दस्सने आं जे एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली च सेरामाइड दी श्रृंखला दी लंबाई इस छंटाई चयनात्मकता आस्तै मती जरूरी ऐ। साढ़ा अध्ययन स्रावी मार्ग च चयनात्मक निर्यात साइटें च लिपिड श्रृंखला दी लंबाई दे आधार उप्पर प्रोटीन कार्गो गी वर्गीकृत करने आस्तै पैह् ले प्रत्यक्ष इन विवो सबूत प्रदान करदा ऐ।
यूकेरियोटिक कोशिकाएं च एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) च संश्लेषित प्रोटीन गी इसदे बाद स्रावी मार्ग दे माध्यम कन्नै परिवहन दे दौरान छंटाई करियै उंदी उचित कोशिका गंतव्य तगर पजाया जंदा ऐ (1) कोट-मध्यस्थ छंटाई दे अलावा, एह् लंबे समें थमां अनुमान लाया गेआ हा जे किश लिपिड उ’नेंगी विशिष्ट झिल्ली डोमेन च समूहीकृत करियै चयनात्मक निकास बिंदु दे रूप च बी कम्म करी सकदे न जेह् ड़े विशिष्ट प्रोटीन (2-5) न। लेकन इस संभावित लिपिड आह्ले तंत्र गी सिद्ध करने आस्तै अजें बी सीधे इन विवो सबूत दी कमी ऐ । इस बुनियादी समस्या गी हल करने आस्तै, असें खमीर च अध्ययन कीता जे किस चाल्लीं ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (जीपीआई) एंकर प्रोटीन (जीपीआई-एपी) गी ईआर थमां बक्ख-बक्ख रूप कन्नै निर्यात कीता जंदा ऐ। जीपीआई-एपी लिपिड कन्नै जुड़े दे कोशिका सतह प्रोटीन दी किस्म ऐ ( 6 , 7 ) । जीपीआई-एपी इक स्रावित प्रोटीन ऐ जेह्ड़ा ग्लाइकोलिपिड अंश (जीपीआई एंकर) दे माध्यम कन्नै प्लाज्मा झिल्ली दे बाहरी पत्रें कन्नै जुड़े दा ऐ । एह् जीपीआई एंकर गी ईआर लुमेन च रूढ़िवादी अनुवाद दे बाद दे संशोधन दे रूप च स्वीकार करदे न (8)। लगाव दे बाद जीपीआई-एपी ईआर थमां गोल्गी यंत्र (5, 9) थमां प्लाज्मा झिल्ली च गुजरा करदा ऐ। जीपीआई एंकर दी मौजूदगी दे कारण जीपीआई-एपी गी स्रावी मार्ग दे कन्नै-कन्नै ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन (जिंदे च होर प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन बी शामल न) थमां बक्ख-बक्ख परिवहन कीता जंदा ऐ (5, 9, 10)। खमीर कोशिकाएं च जीपीआई-एपी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम च होर स्रावित प्रोटीन थमां बक्ख कीते जंदे न, ते फिर कोट प्रोटीन परिसर II (COPII) (6, 7) कन्नै लपेटे दे अनोखे पुटिकाएं च पैक कीते जंदे न। ईआर निर्यात प्रक्रिया च इस वर्गीकरण प्रक्रिया दे निर्धारक अस्पष्ट न, पर एह् अनुमान लाया जंदा ऐ जे इस तंत्र च लिपिड दी लोड़ हो सकदी ऐ, खास करियै जीपीआई एंकर दे लिपिड हिस्से दे संरचनात्मक रिमोडलिंग ( 5 , 8 ) खमीर च जीपीआई लिपिड रिमोडलिंग जीपीआई दे अटैच होने दे तुरंत बाद शुरू होंदी ऐ , ते मते सारे मामलें च एह् सेरामाइड गी 26 कार्बन दी लंबी श्रृंखला दे संतृप्त फैटी एसिड (C26:0) कन्नै जुड़ने दा कारण बनदा ऐ (11, 12) C26 सेरामाइड अजें तगर खमीर कोशिकाएं आसेआ पैदा कीता गेआ मुक्ख सेरामाइड ऐ। एह् ईआर च संश्लेषित होंदा ऐ ते इसदा मता हिस्सा सीओपीआईआई पुटिकाएं दे माध्यम कन्नै गोल्गी यंत्र च निर्यात कीता जंदा ऐ ( 13 ) । जीपीआई-एपी दे ईआर निर्यात च खास तौर उप्पर जारी सेरामाइड संश्लेषण (14, 15) दी लोड़ होंदी ऐ, ते बदले च, गोल्गी यंत्र च सेरामाइड दा इनोसिटोल फास्फेट सेरामाइड (आईपीसी) च बदलाव जीपीआई एंकर संश्लेषण पर निर्भर करदा ऐ (16)। कृत्रिम झिल्ली कन्नै जैव भौतिक अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे बड़ी लम्मी एसिली श्रृंखला दे सेरामाइड्स इकट्ठे होई सकदे न ते अनोखे भौतिक गुणें कन्नै क्रमबद्ध डोमेन बनाई सकदे न ( 17 , 18 ) । इनें आंकड़ें कन्नै एह् परिकल्पना पैदा होंदी ऐ जे सी 26 सेरामाइड ते सी 26 सेरामाइड कन्नै जीपीआई-एपी अपने भौतिक गुणें दा उपयोग करियै अपेक्षाकृत गन्दा ईआर झिल्ली लिपिड वातावरण च व्यवस्थित क्षेत्रें जां क्षेत्रें च इकट्ठा होई जंदे न। एह् मुख्य रूप कन्नै लघु ते असंतृप्त ग्लिसरॉलिपिड्स (C16:1 ते C18:1) (19, 20) कन्नै रचे दा ऐ । एह् क्षेत्र चुनिंदा रूप कन्नै विशिष्ट ईआर निकास साइटें (ईआरईएस) पर केंद्रत होङन, जित्थें सेरामाइड ते सेरामाइड आह्ले जीपीआई-एपी गी इक गै समर्पित सीओपीआई पुटिका च गोल्गी च सह-परिवहन कीता जाई सकदा ऐ (5)।
इस अध्ययन च, असें इस लिपिड आह् ले तंत्र दा सीधा परीक्षण सुपर-रिजोल्यूशन कन्फोकल रियल-टाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (SCLIM) दा उपयोग करियै कीता ऐ, जेह् ड़ी इक अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक ऐ जेह् ड़ी इक गै समें च फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीनें दा निरीक्षण करी सकदी ऐ त्रि-रंग ते त्रि-आयामी (3D) छवियें च जिंदा कोशिकाएं च बेह् तर उच्च रिजोल्यूशन ते गति होंदी ऐ (21, 22)।
अस पैह् ले एससीएलआईएम तकनीक गी होर परिभाशित करने आस्तै लागू कीता जे किस चाल्लीं सी 26 सेरामाइड समूह कन्नै सामान्य जीपीआई-एपी गी एस. ईआर दे वर्गीकरण दी जांच करने आस्तै, असें इक आनुवांशिक प्रणाली दा इस्तेमाल कीता जेह् ड़ी सीधे विवो च ईआरईएस च दाखल होने आह् ले नमें संश्लेषित माल दी कल्पना करी सकदी ऐ ( 7 , 23 )। कार्गो दे रूप च, असें ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) कन्नै लेबल C26 सेरामाइड-आधारत GPI-AP Gas1 ते निकट-अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन (iRFP) कन्नै लेबल ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2 चुनेआ, जेह् ड़े दोऐ प्लाज्मा झिल्ली (24-26) गी निशाना बनांदे न। sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तन च एह् दोऐ माल गैलेक्टोज-प्रेरक प्रवर्तक ते इक संरचनात्मक ईआरएस मार्कर दे हेठ व्यक्त कीते जंदे न। चरम तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पर, कीजे sec31-1 उत्परिवर्तन COPII अंकुरण ते ईआर निर्यात गी रोकने आस्तै COPII कोट घटक Sec31 दे कार्य गी प्रभावित करदा ऐ, इस करी नमें संश्लेषित माल ईआर (23) पर जमा होई जंदा ऐ। घट्ट तापमान (24 डिग्री सेल्सियस) च ठंडा होने दे बाद sec31-1 उत्परिवर्तन कोशिकाएं स्रावी क्षेत्र थमां बरामद होई गेइयां, ते इकट्ठे कीते गेदे नमें सिंथेटिक माल गी ईआर थमां निर्यात करना शुरू होई गेआ। सीएलआईएम विज़ुअलाइज़ेशन ने दस्सेआ जे नमें संश्लेषित Gas1-GFP ते Mid2-iRFP दे मते सारे 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन दे बाद बी sec31-1 उत्परिवर्तन कोशिकाएं दे ईआर च इकट्ठे होंदे न ते फिर 24 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तगर जारी होंदे न (चित्र 1) चूंकि Mid2-iRFP पूरी ईआर झिल्ली पर बंड्डेआ जंदा ऐ, ते Gas1-GFP असतत ईआर झिल्ली दे क्षेत्र च केंद्रत ते इकट्ठा कीता जंदा ऐ, इस करियै उंदा बंड बिल्कुल बक्खरा ऐ (चित्र 1, ए थमां सी ते मूवी एस 1)। इसदे अलावा, जि’यां चित्र 1D च दिक्खेआ गेआ ऐ, गैस1-जीएफपी क्लस्टर च मिड2-आईआरएफपी नेईं ऐ। एह् नतीजे इस गल्लै गी दस्सनदे न जे जीपीआई-एपी ते ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन गी शुरू च बक्ख-बक्ख ईआर झिल्ली क्षेत्रें च बक्ख कीता गेआ हा। Gas1-GFP क्लस्टर mCherry दे COPII कोट प्रोटीन Sec13 (चित्र 1, ई ते एफ, ते फिल्म S1) (23) कन्नै लेबल कीते गेदे इक विशिष्ट ERES कन्नै सटे दा ऐ।
sec31-1 कोशिकाएं गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव गी व्यक्त करदियां न, इक लम्मी एसिली श्रृंखला (C26) सेरामाइड जीपीआई-एपी गैस1-जीएफपी (जीपीआई-एपी, हरा) ते ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन मिड2-आईआरएफपी (टीएमपी, नीला) ते इस रचनात्मक ईआरईएस लेबलिंग Sec13-mCherry (ईआरईएस, मैजेंटा) गी 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ, जिस च लेई गेआ 24°C, ते 5 मिनट बाद एससीएलआईएम द्वारा इमेज कीती गेई। (ए थमां सी) इक विमान (ए) दी प्रतिनिधि मर्ज कीती गेदी जां इकल 2D छवि, 10 z-खंडें (बी) दी 2D प्रोजेक्शन छवि जां माल ते ईआरएस मार्करें (सी) दी 3D कोशिका गोलार्ध छवि दस्सदा ऐ। पैमाने बार 1μm (ए ते बी)। पैमाने दी इकाई 0.551μm (C) ऐ। Gas1-GFP दा पता असतत ईआर क्षेत्रें जां समूहें च लाया गेआ हा, जदके Mid2-iRFP दा पता लाया गेआ हा ते पूरे ईआर झिल्ली (सी) च बंड्डेआ गेआ हा। (D) ग्राफ च सफेद तीर रेखा (बाएं) दे कन्नै-कन्नै Gas1-GFP क्लस्टर च Gas1-GFP ते Mid2-iRFP दी सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता दस्सदा ऐ। एयू, मनमाना इकाई। (ई ते एफ) 3 डी छवि दा प्रतिनिधित्व करदे न जेह् ड़ी माल ते ईआरईएस निशान गी इकट्ठा करदी ऐ। गैस1-जीएफपी क्लस्टरें दा पता विशिष्ट ईआरईएस दे कोल लाया गेआ। पैमाने दी इकाई 0.551μm ऐ। (F) सफेद ठोस तीर ERES कन्नै जुड़े दे Gas1-GFP क्लस्टर गी चिऱन्नत करदा ऐ। बिच्चले ते सज्जे पैनल च मर्ज कीती गेदी बधाए गेदे 3D छवि ते चयनित Gas1-GFP क्लस्टर दा घुमावदार दृश्य दस्सदा ऐ।
गैस 1-जीएफपी क्लस्टर ते इक विशिष्ट ईआरईएस दे बश्कार घट्ट स्थानिक रिश्ता इस गल्लै गी दर्शांदा ऐ जे गैस 1-जीएफपी चयनात्मक ईआरईएस च दाखल होई सकदा ऐ, जेह् ड़ी ईआर छोड़ने लेई मिड2-आईआरएफपी आसेआ इस्तेमाल कीती जाने आह् ली चयनात्मकता थमां बक्ख ऐ। इस संभावना गी संबोधित करने आस्तै, असें सिर्फ इक जां दो माल आस्तै ईआरईएस अनुपात दी मात्रा निर्धारित कीती (चित्र 2, ए थमां सी)। असें गी पता चलेआ जे मते सारे ईआरईएस (70%) च सिर्फ इक किस्म दा माल होंदा ऐ। चित्र 2C दी निचली छवि च सिर्फ Gas1-GFP (चित्र 1) जां सिर्फ Mid2-iRFP (चित्र 2) कन्नै ERES दे दो ठेठ उदाहरण दिक्खे गे न। इसदे बरोबर, लगभग 20% ईआरईएस च दो माल होंदे न जेह् ड़े इक गै इलाके च ओवरलैप होंदे न। एह् दिक्खेआ गेआ जे किश ईआरएस (10%) च दो किस्म दे माल हे, पर एह् साफ तौर उप्पर बक्ख-बक्ख इलाकें च अलग-थलग हे। इसलेई एह् सांख्यिक विश्लेषण दस्सदा ऐ जे ईआर निर्यात होने दे बाद जीपीआई-एपी गैस1-जीएफपी ते ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो मिड2-आईआरएफपी गी बक्ख-बक्ख ईआरईएस च बंडेआ जंदा ऐ (चित्र 2 डी)। एह् छंटाई दी दक्षता पिछले जैव रासायनिक विश्लेषण (6) ते रूपात्मक निर्धारण (7) कन्नै मती मेल खंदा ऐ । अस ईआरईएस च दाखल होने आह् ले क्वारंटाइन कीते गेदे माल दे बर्ताव दा बी निरीक्षण करी सकने आं (चित्र 2ई ते मूवी एस2)। चित्र 2E दस्सदा ऐ जे गैस1-जीएफपी (पैनल 3) जां मिड2-आईआरएफपी (पैनल 4) दा इक छोटा हिस्सा इक पास्सै थमां ईआरईएस च दाखल होंदा ऐ ते इक असतत क्षेत्र च सीमित ऐ। चित्र 2E दे पैनल 5 च दस्सेआ गेआ ऐ जे Gas1-GFP ते Mid2-iRFP कदें-कदें इक गै ERES च पाये जंदे न, पर एह् बक्ख-बक्ख पास्सें थमां दाखल होंदे न ते बक्ख-बक्ख क्षेत्रें च केंद्रत होंदे न जेह्ड़े बक्ख-बक्ख COPII पुटिकाएं दा प्रतिनिधित्व करी सकदे न। असें एह् बी पुष्टि कीती ऐ जे चयनात्मक ईआरईएस दे रूप च C26 सेरामाइड आह् ले GPI-AP Gas1 दा दिक्खे गेदे पृथक्करण ते वर्गीकरण विशिष्ट ऐ की जे इक होर ट्रांसमेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Axl2 (27 ), Mid2-iRFP दे समान व्यवहार दस्सदा ऐ। (चित्र एस 1 ते मूवी एस 3)। नमें संश्लेषित Axl2-GFP गी Mid2-iRFP (चित्र S1, A ते B) जनेह् ईआर झिल्ली दे माध्यम कन्नै वितरित कीता जंदा ऐ, ते मते सारे ERES च Mid2-iRFP कन्नै सह-स्थानीय होंदा ऐ (चित्र S1, B थमां D)। चित्र 1 दे पैनल 1 ते 2 एस 1 सी ईआरईएस दे दो ठेठ उदाहरण दस्सदा ऐ जित्थें दो ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो ओवरलैप होंदे न। इनें मामलें च, दौंऊ माल इकट्ठे ईआरईएस च दाखल होंदे न (चित्र S1E, पैनल 3 ते मूवी S3)।
गैलेक्टोज प्रेरक स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, हरे) ते Mid2-iRFP (TMP, नीले) ते संरचनात्मक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, magenta) गी व्यक्त करने आह् ले sec31-1 कोशिकाएं गी 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तगर इन्क्यूबेशन करने दे बाद, स्राव ब्लॉक गी जारी करने आस्तै 24 डिग्री सेल्सियस पर लेई गेआ, ते इसदे बाद SCLIM कन्नै छवि बनाई गेई 20 मिनट दा। (ए थमां सी) कार्गो दी प्रतिनिधि 2 डी प्रोजेक्शन छवियां (ए; पैमाने पर बार, 1μm) जां 3 डी कोशिका गोलार्ध छवियां (बी ते सी; पैमाने इकाई, 0.456μm) ते ईआरईएस द्वारा चिह्नित 10 जेड-खंड। (बी) च निचले पैनल ते (सी) च पैनल प्रसंस्करण छवियें गी प्रदर्शत करदा ऐ तां जे सिर्फ ईआरईएस (मैजेंटा) [गैस1-जीएफपी (ग्रे) ते मिड2-आईआरएफपी (हल्के नीले रंग) च मौजूद माल गी प्रदर्शत कीता जाई सकै। (C) खुला तीर: ईआरईएस सिर्फ इक टुकड़ा माल (1 थमां 4) लेई जंदा ऐ। ग्रे तीर: ईआरईएस च अलग-थलग माल (5) होंदा ऐ। सफेद ठोस तीर: सह-स्थापित माल युक्त ईआरईएस। हेठ: चयनित इकल ईआरईएस च सिर्फ गैस1-जीएफपी (1) जां मिड2-आईआरएफपी (2) शामल ऐ। पैमाने पर बार, 100 एनएम। (D) (C) च वर्णत फोटोमाइक्रोग्राफ दी मात्रा निर्धारण। ईआरईएस दा औसत प्रतिशत जिस च सिर्फ इक माल (गैस1-जीएफपी जां मिड2-आईआरएफपी), अलग-थलग माल ते ओवरलैपिंग माल होंदा ऐ। त्रै स्वतंत्र प्रयोगें च, 54 कोशिकाएं च n=432। त्रुटि बार = एसडी। दो-पूंछ बिना जोड़ीदार टी परीक्षण। *** पी = 0.0002 ऐ। (ई) (सी) कन्नै चिह्नित क्वारंटाइन कार्गो दे चयनित ईआरईएस दी 3 डी छवि। गैस1-जीएफपी (हरा) (3) जां मिड2-आईआरएफपी (नीला) (4) इक पास्सै ईआरईएस (मैजेंटा) च दाखल होंदा ऐ ते ईआरईएस दे अंदर इक निक्के क्षेत्र च सीमित ऐ। कदें-कदें, दौनें किस्म दे माल इक गै पास्सै थमां इक गै ईआरईएस (5) च दाखल होंदे न ते ईआरईएस दे अंदर इक अलग-थलग इलाके च सीमित रौंह्दे न। पैमाने पर बार, 100 एनएम।
अगले, असें इक परिकल्पना दा परीक्षण कीता जे ईआर झिल्ली च मौजूद लंबी एसिली श्रृंखला सेरामाइड (C26) गैस1 दे विशिष्ट क्लस्टरिंग ते छंटाई गी चयनात्मक ईआरईएस च चलांदा ऐ। इस अंत च, असें इक संशोधित खमीर तनाव GhLag1 दा इस्तेमाल कीता, जिस च दो अंतर्जात सेरामाइड सिन्थेज Lag1 ते Lac1 गी GhLag1 (कपास दा Lag1 होमोलॉग) कन्नै बदली दित्ता गेआ, जिसदे फलस्वरूप जंगली किस्म थमां घट्ट कोशिका झिल्ली सेरामाइड तनाव कन्नै खमीर तनाव पैदा होआ (चित्र 3 ए) (28)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषण ने दस्सेआ जे जंगली किस्म दे उपभेदें च कुल सेरामाइड दा 95% बड्डा लम्मे (C26) श्रृंखला सेरामाइड ऐ, जदके GhLag1 च 85% सेरामाइड बड़ा लम्मे (C18 ते C16) ऐ। ), सेरामाइड दा सिर्फ 2% हिस्सा बड़ा लम्मे (C26) श्रृंखला सेरामाइड ऐ। हालांकि C18 ते C16 सेरामाइड अजें तगर GhLag1 झिल्ली च पता लाए गेदे मुक्ख सेरामाइड न, पर एमएस विश्लेषण ने एह् बी पुष्टि कीती ऐ जे GhLag1 तनाव च व्यक्त कीते गेदे Gas1-GFP दे GPI एंकर च C26 सेरामाइड ऐ, जेह्ड़ा जंगली किस्म दे लिपिड कन्नै तुलनीय ऐ। गुणवत्ता इक ही है (चित्र 3 ए) (26)। इसलेई इसदा मतलब ऐ जे सेरामाइड रिमोडलिंग एन्जाइम Cwh43 C26 सेरामाइड आस्तै मता चयनात्मक ऐ , जि’यां चित्र 26 च दिक्खेआ गेआ ऐ , एह् प्राथमिकता कन्नै GhLag1 तनाव च C26 सेरामाइड दी थोड़ी मात्रा थमां जीपीआई एंकर गी शामल करदा ऐ एस 2 (29) ऐ। इसदे बावजूद, GhLag1 दी कोशिका झिल्ली च मूल रूप कन्नै सिर्फ C18-C16 सेरामाइड होंदा ऐ, जदके Gas1-GFP च अजें बी C26 सेरामाइड होंदा ऐ। एह् तथ्य इस तनाव गी ईआर च झिल्ली सेरामाइड दी एसिली श्रृंखला दी लंबाई दी समस्या गी विशेश रूप कन्नै हल करने आस्तै इक आदर्श उपकरण बनांदा ऐ। वर्ग ते छंटाई दी काल्पनिक भूमिका। फिर, असें पैह् ले परंपरागत फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी दे माध्यम कन्नै sec31-1 दे तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित एलील कन्नै GhLag1 च समूहें च जमा होने दी C26 Gas1-GFP दी क्षमता दा अध्ययन कीता, जित्थें ईआर झिल्ली सेरामाइड च सिर्फ लंबी (C18-C16) श्रृंखला मौजूद ऐ (चित्र 3)। असें दिक्खेआ जे sec31-1 च, Gas1-GFP दा मता हिस्सा समूहें च केंद्रित हा, जिसलै के लंबे (C18-C16) लम्मे (C18-C16) लम्मी सेरामाइड ईआर झिल्ली कन्नै sec31-1 GhLag1 च Gas1-GFP मुख्य रूप कन्नै समूहीकृत नेईं हा ते पूरी ईआर झिल्ली च वितरित नेईं हा। सटीक आखने आस्तै, कीजे C26 सेरामाइड आह् ला क्लस्टरिंग विशिश्ट ईआरईएस (चित्र 1) कन्नै नेड़में कन्नै सरबंधत ऐ, इस करियै असें अगले जांच कीती जे इस प्रक्रिया च ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्र दे कम्मै च बी शामल होई सकदा ऐ। जीपीआई-एपी ईआर निर्यात लेई इक खास सीओपीआई प्रणाली दा उपयोग करदा ऐ, जेह् ड़ी जीपीआई एंकर (30, 31) दे ग्लाइकन हिस्से दी Ted1 दे संरचनात्मक रिमोडलिंग कन्नै सक्रिय रूप कन्नै नियंत्रित कीती जंदी ऐ। इसदे बाद पुनर्संयोजित जीपीआई-ग्लाइकन गी ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 परिसर आसेआ पन्छानेआ जंदा ऐ, जेह् ड़ा बदले च चुनिंदा रूप कन्नै Lst1 गी भर्ती करदा ऐ, जेह् ड़ा प्रमुख COPII कार्गो बाइंडिंग सब-यूनिट Sec24 दा इक विशिष्ट आइसोफॉर्म ऐ, जिस कन्नै इक GPI-AP-समृद्ध COPII पुटिकाएं दा निर्माण कीता जंदा ऐ (31-33)। इसलेई, असें इक डबल म्यूटेंट दा निर्माण कीता जेह् ड़ा इनें इकल प्रोटीनें (p24 जटिल घटक Emp24, GPI-ग्लाइकन रिमोडलिंग एंजाइम Ted1 ते विशिष्ट COPII उप-इकाई Lst1) दे डिलीशन गी sec31-1 उत्परिवर्तित तनाव कन्नै जोड़ेआ, ते उंदा अध्ययन कीता Is it possible to form Gas1-cluster GFP (चित्र 3)। असें दिक्खेआ जे sec31-1emp24Δ ते sec31-1ted1Δ च, Gas1-GFP मुख्य रूप कन्नै अनक्लस्टर ते पूरे ईआर झिल्ली च वितरित ऐ, जि’यां पैह् ले sec31-1 GhLag1 च दिक्खेआ गेआ ऐ, जिसलै के sec31-1lst1Δ च, Gas1-GFP Like sec31-1। एह् नतीजे इस गल्लै गी दस्सन जे ईआर झिल्ली च C26 सेरामाइड दी मौजूदगी दे अलावा, Gas1-GFP दे क्लस्टरिंग गी बी p24 परिसर कन्नै जुड़ने दी लोड़ ऐ, ते विशिश्ट Lst1 भर्ती दी लोड़ नेईं ऐ। फिर, असें इस संभावना दी खोज कीती जे ईआर झिल्ली च सेरामाइड दी श्रृंखला दी लंबाई Gas1-GFP दे p24 कन्नै बंड गी नियंत्रित करी सकदी ऐ। हालांकि, असें गी पता चलेआ जे झिल्ली च C18-C16 सेरामाइड दी मौजूदगी p24 परिसर (चित्र S3 ते S4, A ते B) द्वारा पुनर्निर्माण कीते गेदे GPI-ग्लाइकन गी प्रभावित नेईं करदी ऐ जां GPI-AP कन्नै जुड़ने ते GPI-AP निर्यात करने च। समर्था। COPII उपप्रकार Lst1 (चित्र S4C) भर्ती करो। इसलेई C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग च बक्ख-बक्ख ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्रें कन्नै प्रोटीन परस्पर क्रियाएं दी लोड़ नेईं ऐ, पर लिपिड दी लंबाई कन्नै संचालित वैकल्पिक छंटाई तंत्र दा समर्थन करदा ऐ। फिर, असें विश्लेषण कीता जे ईआर झिल्ली च सेरामाइड एसिली श्रृंखला दी लंबाई चयनात्मक ईआरईएस दे रूप च गैस1-जीएफपी दे प्रभावी वर्गीकरण लेई महत्वपूर्ण ऐ जां नेईं। चूंकि शॉर्ट-चेन सेरामाइड कन्नै GhLag1 तनाव च Gas1 ईआर थमां निकलदा ऐ ते प्लाज्मा झिल्ली च दाखल होंदा ऐ (चित्र S5), इस करियै असें गी विश्वास ऐ जे जेकर छंटाई सेरामाइड एसिल श्रृंखला दी लंबाई कन्नै चलाया जंदा ऐ तां GhLag1 तनाव च Gas1 गी पुनर्निर्देशित ते पार कीता जाई सकदा ऐ। उसी झिल्ली कन्नै ईआरईएस माल।
(A) GhLag1 दी कोशिका झिल्ली च मुख्य रूप कन्नै छोटे C18-C16 सेरामाइड होंदे न, जदके Gas1-GFP दे GPI एंकर च अजें बी जंगली किस्म दे कोशिकाएं दे समान C26 आईपीसी ऐ। ऊपर: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा जंगली किस्म (Wt) ते GhLag1p उपभेदें दी कोशिका झिल्ली च सेरामाइड दा एसिली श्रृंखला लंबाई विश्लेषण। डेटा कुल सेरामाइड दे प्रतिशत दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। त्रै स्वतंत्र प्रयोगें दी औसत। त्रुटि बार = एसडी। दो-पूंछ बिना जोड़ीदार टी परीक्षण। **** पी <0.0001 ऐ। निचले पैनल: जंगली किस्म दे ते GhLag1p उपभेदें च व्यक्त कीते गेदे Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI एंकर च मौजूद आईपीसी दी एसिली श्रृंखला दी लंबाई दा एमएस विश्लेषण। डेटा कुल आईपीसी सिग्नल दे प्रतिशत दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। पंज स्वतंत्र प्रयोगें दी औसत। त्रुटि बार = एसडी। दो-पूंछ बिना जोड़ीदार टी परीक्षण। ns, महत्वपूर्ण नहीं। पी = 0.9134 ऐ। (B) गैलेक्टोज-प्रेरित Gas1-GFP गी व्यक्त करने आह् ले sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ते sec31-1lst1Δ कोशिकाएं दे प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ गी 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ ते बाद च नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करने आस्तै पास कीता गेआ 24 डिग्री सेल्सियस ऐ। सफेद तीर: ईआर गैस1-जीएफपी क्लस्टर। खुल्ला तीर: अनक्लस्टर गैस1-जीएफपी पूरी ईआर झिल्ली पर बंड्डेआ जंदा ऐ, जिस च ईआर विशेषता न्यूक्लियर रिंग धुंधलापन दिक्खेआ जंदा ऐ। पैमाने पर बार, 5μm। (C) (B) च वर्णत फोटोमाइक्रोग्राफ दी मात्रा निर्धारण। पंकटेट Gas1-GFP संरचना कन्नै कोशिकाएं दा औसत प्रतिशत। त्रै स्वतंत्र प्रयोगें च, n≥300 कोशिकाएं। त्रुटि बार = एसडी। दो-पूंछ बिना जोड़ीदार टी परीक्षण। **** पी <0.0001 ऐ।
इस समस्या गी सीधे हल करने आस्तै, असें sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित एलील (चित्र 4 ते मूवी S4) कन्नै GhLag1 च Gas1-GFP ते Mid2-iRFP दा SCLIM विज़ुअलाइज़ेशन कीता। ईआर गी 37 डिग्री सेल्सियस पर बरकरार रखने ते बाद च 24 डिग्री सेल्सियस पर जारी करने दे बाद, नमें संश्लेषित गैस 1-जीएफपी दे मते सारें गी समूहीकृत ते पूरे ईआर झिल्ली च बंड नेईं कीता गेआ, जि’यां परंपरागत सूक्ष्मदर्शी कन्नै दिक्खेआ गेआ ऐ (चित्र 4, ए ते बी) इसदे अलावा, ईआरईएस दे इक बड्डे प्रतिशत (67%) च इस च सह-स्थापित दो किस्म दे माल शामल न (चित्र 4 डी)। चित्र 4 सी दे पैनल 1 ते 2 ओवरलैपिंग गैस1-जीएफपी ते मिड2-जीएफपी कन्नै ईआरईएस दे दो ठेठ उदाहरण दस्सदे न। इसदे अलावा, दौनें माल गी इक गै ईआरईएस च भर्ती कीता गेआ (चित्र 4ई, पैनल 3 ते फिल्म एस4)। इसलेई साढ़े नतीजें दा संकेत ऐ जे ईआर झिल्ली च सेरामाइड एसिली श्रृंखला दी लंबाई ईआर प्रोटीन दे इकट्ठे होने ते वर्गीकरण दा इक महत्वपूर्ण निर्धारक ऐ।
गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, हरे) ते Mid2-iRFP (TMP, नीले) ते संरचनात्मक ERES-लेबल Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) गी व्यक्त करने आह् ले Sec31-1 GhLag1 कोशिकाएं गी 37 डिग्री सेल्सियस पर इन्क्यूब कीता जंदा ऐ। 30 मिंट तगर जारी रक्खो, स्राव जारी करने आस्तै 24 डिग्री सेल्सियस तगर घट्ट करो, ते 20 मिंटें दे बाद एससीएलआईएम कन्नै इमेज करो। (ए थमां सी) कार्गो ते ईआरईएस कन्नै चिह्नित 10 जेड-खंडें दे प्रतिनिधि 2 डी प्रोजेक्शन छवियां (ए; पैमाने पर बार, 1μm) जां 3 डी कोशिका गोलार्ध छवियां (बी ते सी; पैमाने इकाई, 0.45μm)। (बी) च निचले पैनल ते (सी) च पैनल प्रसंस्करण छवियें गी प्रदर्शत करदा ऐ तां जे सिर्फ ईआरईएस (मैजेंटा) [गैस1-जीएफपी (ग्रे) ते मिड2-आईआरएफपी (हल्के नीले रंग) च मौजूद माल गी प्रदर्शत कीता जाई सकै। (सी) सफेद भरे तीर: ईआरईएस, माल ओवरलैप। खुला तीर: ईआरईएस च सिर्फ इक गै आइटम ऐ। निचले पैनल: चयनित ईआरईएस च (सी) च चिऱन्नत ओवरलैपिंग माल (1 ते 2) ऐ। पैमाने पर बार, 100 एनएम। (D) (C) च वर्णत फोटोमाइक्रोग्राफ दी मात्रा निर्धारण। sec31-1 ते sec31-1 GhLag1 इकाइयें च, सिर्फ इक माल (Gas1-GFP जां Mid2-iRFP) शामल ऐ, ते अलग-थलग माल ते ओवरलैपिंग कार्गो आस्तै ईआरईएस दा औसत प्रतिशत। त्रै स्वतंत्र प्रयोगें च, 54 कोशिकाएं च n = 432 (sec31-1) ते 47 कोशिकाएं च n = 430 (sec31-1 GhLag1)। त्रुटि बार = एसडी। दो-पूंछ बिना जोड़ीदार टी परीक्षण। *** पी = 0.0002 (sec31-1) ते ** पी = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (ई) (सी) च चिह्नित ओवरलैपिंग कार्गो (3) कन्नै चयनित ईआरईएस दी 3 डी छवि। गैस1-जीएफपी (हरा) ते मिड2-आईआरएफपी (नीला) इक गै पास्सै ईआरईएस (मैजेंटा) दे कोल औंदे न ते इक गै ईआरईएस प्रतिबंधित क्षेत्र च रौंह्दे न। पैमाने पर बार, 100 एनएम।
एह् अध्ययन इस गल्लै दा सीधा इन विवो सबूत दिंदा ऐ जे लिपिड आह् ले प्रोटीन कार्गो गी स्रावी मार्ग च चयनात्मक निर्यात साइटें च वर्गीकृत कीता जंदा ऐ, ते वर्गीकरण चयनात्मकता आस्तै एसिली श्रृंखला दी लंबाई दा महत्व उजागर करदा ऐ। एससीएलआईएम नांऽ दी इक शक्तिशाली ते अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक दा उपयोग करदे होई असें खमीर च नमें संश्लेषित गैस 1-जीएफपी (एक बड्डा प्लाज्मा झिल्ली जीपीआई-एपी) दा प्रदर्शन कीता जेह् ड़ा इक बड्डी लम्मी एसिली श्रृंखला (सी 26) सेरामाइड लिपिड हिस्से कन्नै ऐ ) असतत ईआरएस च समूहीकृत क्षेत्र विशिष्ट ईआरईएस कन्नै जुड़े दे न, जिसलै के ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन पूरे ईआर झिल्ली च बंड्डे गेदे न (चित्र 1) दा। इसदे अलावा, एह् दो किस्म दे माल बक्ख-बक्ख ईआरएस च चुनिंदा रूप कन्नै दाखल होंदे न (चित्र 2)। झिल्ली च सेलुलर सेरामाइड दी एसिल श्रृंखला दी लंबाई C26 थमां C18-C16 च घट्ट होई जंदी ऐ, Gas1-GFP क्लस्टर गी असतत ईआर क्षेत्र च बाधित कीता जंदा ऐ, ते Gas1-GFP गी उस्सै ईआरईएस दे माध्यम कन्नै ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन कन्नै ईआर गी छोड़ने आस्तै पुनर्मार्गित कीता जंदा ऐ (चित्र 3 ते चित्र 3)। 4) ऐ।
हालांकि जीपीआई-एपी ईआर थमां बाह् र निकलने आस्तै इक विशेश प्रोटीन तंत्र दा उपयोग करदा ऐ , पर असें गी पता चलेआ जे सी 26 सेरामाइड-निर्भर पृथक्करण विभेदक प्रोटीन परस्पर क्रियाएं पर निर्भर नेईं करदा ऐ जेह् ड़ा ईआरईएस विशेशता पैदा करी सकदा ऐ (चित्र S4 ते S5)। इसदे बजाय, साढ़े निष्कर्ष लिपिड आह् ले प्रोटीन क्लस्टरिंग ते बाद च होर माल गी बहिष्कार करने कन्नै संचालित इक वैकल्पिक वर्गीकरण तंत्र दा समर्थन करदे न। साढ़े निरीक्षणें दा संकेत ऐ जे इक विशिष्ट ईआरईएस कन्नै जुड़े दे गैस 1-जीएफपी क्षेत्र जां क्लस्टर च ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन मिड2-आईआरएफपी दी कमी ऐ, जेह् ड़ा इस गल्लै गी दर्शांदा ऐ जे सी 26 सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टर उंदे कन्नै सरबंधत ईआरईएस च प्रवेश गी सुविधाजनक बनाग, ते इसदे कन्नै गै, ट्रांसमेम्ब्रेन गी बाहर कड्ढदे न स्राव इस खास ईआरएस च प्रवेश करदे न (चित्र 1 ते 2) इसदे बरोबर, ईआर झिल्ली च C18-C16 सेरामाइड दी मौजूदगी कन्नै जीपीआई-एपी दे क्षेत्र जां समूह पैदा नेईं होंदे न, इस करी एह् ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन गी इक गै ईआरईएस च बाहर नेईं करदे न जां नेईं बदलदे न (चित्र 3 ते 4) . इसलेई, अस प्रस्ताव करने आं जे C26 सेरामाइड विशिश्ट ईआरईएस कन्नै जुड़े दे प्रोटीन दे क्लस्टरिंग गी सुविधाजनक बनाइयै बक्ख-बक्ख ते वर्गीकरण गी चलांदा ऐ।
इस C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग गी इक विशिष्ट ईआर क्षेत्र च किस चाल्ली हासल कीता जा? झिल्ली सेरामाइड दी पार्श्विक रूप कन्नै बक्ख होने दी प्रवृत्ति दे कारण जीपीआई-एपी ते सी 26 सेरामाइड दे ईआर झिल्ली दे मते अनियमित लिपिड वातावरण च छोटे ते असंतृप्त ग्लिसरॉलिपिड्स होंदे न गुणवत्ता समूह (17, 18) ऐ। इनें छोटे अस्थायी समूहें गी p24 परिसर कन्नै जुड़ने दे बाद होर बड्डे, मते स्थिर समूहें च फ्यूज कीता जाई सकदा ऐ ( 34 ) । इसदे अनुरूप, असें दस्सेआ जे C26 Gas1-GFP गी बड्डे दिक्खने आह् ले समूह बनाने लेई p24 परिसर कन्नै परस्पर क्रिया करने दी लोड़ ऐ (चित्र 3)। p24 परिसर खमीर ( 35 ) च चार बक्ख-बक्ख p24 ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीनें कन्नै रचे दा इक विषमलिंगी ओलिगोमर ऐ , जेह्ड़ा बहुसंयोजक बंड प्रदान करदा ऐ , जेह् ड़ा छोटे जीपीआई-एपी समूहें दे क्रॉस-लिंकिंग दा कारण बनी सकदा ऐ , जिस कन्नै बड्डा स्थिर समूह पैदा होई सकदा ऐ ( 34 ) जीपीआई-एपीएस दे प्रोटीन एक्टोडोमेन दे बश्कार परस्पर क्रिया बी उंदे इकट्ठे होने च योगदान करी सकदी ऐ, जि’यां स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाएं च उंदे गोल्गी परिवहन दे दौरान दिक्खेआ गेआ ऐ ( 36 ) । लेकन जदूं ईआर झिल्ली च C18-C16 सेरामाइड मौजूद होंदा ऐ तां जदूं p24 परिसर Gas1-GFP कन्नै जुड़दा ऐ तां बड्डे बक्ख-बक्ख समूह नेईं बनदे न। अंतर्निहित तंत्र लम्मी एसिली श्रृंखला दे सेरामाइड दे विशिष्ट भौतिक ते रासायनिक गुणें उप्पर निर्भर करी सकदा ऐ। कृत्रिम झिल्ली दे जैव भौतिक अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे हालांकि लम्मी (C24) ते लघु (C18-C16) एसिली श्रृंखला दे सेरामाइड दोनें चरणें दे बक्ख-बक्ख होने दा कारण बनी सकदे न, पर सिर्फ लम्मी एसिली श्रृंखला दे सेरामाइड (C24) गै फिल्म गी नमें सिरेआ आकार देने आस्तै उच्च वक्रता ते फिल्म झुकने गी बढ़ावा देई सकदे न। आपसी संदर्भ दे जरिए (17, 37, 38)। एह् दिक्खेआ गेआ ऐ जे TMED2 दा ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स, Emp24 दा मनुक्खी समरूप, चयनात्मक रूप कन्नै साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल च C18 सेरामाइड आह्ले स्फिंगोमाइलिन कन्नै परस्पर क्रिया करदा ऐ ( 39 ) । आणविक गतिशीलता (एमडी) अनुकरणें दा उपयोग करदे होई असें गी पता चलेआ जे C18 ते C26 दोनों सेरामाइड्स Emp24 ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स दे साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल दे आसपास इकट्ठे होंदे न, ते उंदी समान पसंद ऐ (चित्र S6)। ध्यान देने आह् ला ऐ जे एह् दस्सदा ऐ जे Emp24 दे ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स कन्नै झिल्ली च लिपिड दा असममित वितरण होई सकदा ऐ। एह् स्तनधारी कोशिकाएं उप्पर आधारित हालिया नतीजा ऐ । इसी तरह दे एमडी सिमुलेशन बी ईथर लिपिड दी मौजूदगी गी दस्सदे न (40) । इसलेई, अस अनुमान लाने आं जे ईआर26 दे दो लोब्यूल च C26 सेरामाइड स्थानीय रूप कन्नै समृद्ध ऐ। जदूं लुमिनल लोब्यूल च जीपीआई-एपी सीधे बहुसंयोजक पी 24 कन्नै जुड़दा ऐ ते साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल च पी 24 दे आसपास सी 26 सेरामाइड दा संचय होंदा ऐ तां एह् उंगलियें दे माध्यम कन्नै कन्नै होने आह्ले प्रोटीन दे इकट्ठे होने ते झिल्ली वक्रता गी बढ़ावा देई सकदा ऐ ( 41 ), जिस कन्नै जीपीआई-एपी ईआरईएस कन्नै लगदे असतत क्षेत्रें च बक्ख होई जंदा ऐ , जेह्ड़ा उच्च वक्रता दे पक्ष च बी होंदा ऐ ईआर झिल्ली ( 42 ) दे क्षेत्रें च। पिछली रिपोर्टें प्रस्तावित तंत्र दा समर्थन कीता हा (43, 44)। प्लाज्मा झिल्ली पर ओलिगोलेक्टिन, रोगजनक जां एंटीबॉडी दे सेरामाइड आह्ले ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड (GSL) कन्नै बहुसंयोजक बंड बड्डे GSL इकट्ठे होने गी शुरू करदा ऐ, चरण पृथक्करण गी बधांदा ऐ ते झिल्ली विरूपता ते आंतरिकीकरण पैदा करदा ऐ ( 44 ) इवाबुची बगैरा (43) एह् दिक्खेआ गेआ जे लम्मी (C24) पर घट्ट नेईं (C16) एसिली श्रृंखलाएं दी मौजूदगी च जीएसएल लैक्टोसाइलसेरामाइड कन्नै बद्ध बहुसंयोजक लिगांड ने बड्डे समूहें ते झिल्ली दे आक्रमण गी प्रेरित कीता, ते पत्रक पर साइटोप्लाज्म लिन-मध्यस्थ संकेत संप्रेषण गी युग्मित च एसिल श्रृंखलाएं कन्नै इंटरडिजिटेशन कीता जंदा ऐ न्यूट्रोफिल्स दा।
स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाएं च एपिकल प्लाज्मा झिल्ली दे स्तर तकर एंटी-गोल्गी नेटवर्क (TGN) दी सांद्रता जीपीआई-एपी दे बक्ख-बक्ख होने ते छंटाई गी नियंत्रत करदी ऐ (10, 45) एह् इकट्ठा होना जीपीआई-एपी ओलिगोमेराइजेशन ( 36 ) कन्नै चलाया जंदा ऐ , पर एह् सेरामाइड श्रृंखला दी लंबाई उप्पर बी निर्भर करी सकदा ऐ जेह्ड़ी असेंगी खमीर च मिलदी ऐ । हालांकि स्तनधारी जीपीआई-एपी च ईथर लिपिड आह् ला लंगर ऐ, ते इसदी रासायनिक संरचना बड़ी लम्मी एसिली श्रृंखला सेरामाइड थमां मती बक्ख ऐ, पर इक हालिया अध्ययन च पता चलेआ ऐ जे दौनें लिपिड च विकासात्मक रूप कन्नै समान भौतिक ते रासायनिक गुण ते कार्य-प्रणाली ( 40 ) इसलेई स्तनधारी कोशिकाएं च ईथर लिपिड दा हिस्सा खमीर च C26 सेरामाइड दे समान होई सकदा ऐ , ते इसदी भूमिका जीपीआई-एपी इकट्ठे होने ते छंटाई गी बढ़ावा देने आस्तै झिल्ली च लम्मी श्रृंखला दे सेरामाइड कन्नै जुड़ी दी होंदी ऐ हालांकि इस संभावना गी अजें बी सीधे तौर पर परीक्षण करने दी लोड़ ऐ, पर पिछले निष्कर्ष इस गल्लै दा समर्थन करदे न जे गोल्गी शरीर च लम्मी एसिली श्रृंखला दे सेरामाइड दा परिवहन साइटोप्लाज्मिक ट्रांसफर प्रोटीन कन्नै नेईं कीता जंदा ऐ, पर खमीर जनेह् जीपीआई एंकर दे संश्लेषण उप्पर निर्भर करदा ऐ इसलेई विकासवादी रूढ़िवादी तंत्र इक गै परिवहन पुटिका च बड़ी लम्मी एसिली श्रृंखला सेरामाइड ते जीपीआई-एपी (13, 16, 20, 46, 47) गी चुनिंदा रूप कन्नै सह-परिवहन करने च समर्थ दिक्खने गी मिलदा ऐ।
खमीर ते स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका प्रणाली च जीपीआई-एपी दा इकट्ठा होना ते होर प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन थमां बक्ख होना सारें शा पैह्ले कोशिका दी सतह उप्पर पुज्जने थमां पैह्ले होंदा ऐ । पलाडिनो एट अल। (48) ने पाया जे स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाएं दे टीजीएन पर जीपीआई-एपी क्लस्टरिंग न सिर्फ एपिकल प्लाज्मा झिल्ली च जीपीआई-एपी दे चयनात्मक वर्गीकरण लेई जरूरी ऐ, बल्के जीपीआई-एपी दे क्लस्टरिंग संगठन ते इसदी जैविक गतिविधि गी बी नियंत्रत करदा ऐ कोशिका सतह। खमीर च, इस अध्ययन कन्नै पता चलेआ ऐ जे ईआर पर सी 26 सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टर प्लाज्मा झिल्ली पर जीपीआई-एपी दे क्लस्टर संगठन ते कार्यात्मक गतिविधि गी नियंत्रित करी सकदा ऐ ( 24 , 49 ) इस माडल दे अनुरूप, GhLag1 कोशिकाएं गी जीपीआई इंहिबिटरें जां दवाएं थमां एलर्जी होंदी ऐ जेह् ड़ी कोशिका दी दीवार अखंडता गी प्रभावित करदी ऐ ( 28 ), ते खमीर कोशिकाएं दे संभोग च प्रोजेक्ट कीते गेदे टिप सेरामाइड दे कार्यात्मक Gas1-GFP समूहें ( 49 ) दी लोड़ G hLag1 कोशिकाएं दे संभावित शारीरिक नतीजें गी दर्शांदी ऐ जीपीआई-एपी त्रुटि। लेकन होर परीक्षण करना जे कोशिका दी सतह दे कार्यात्मक संगठन गी लिपिड दी लंबाई दे आधार उप्पर छंटाई दे तरीके कन्नै ईआर थमां प्रोग्राम कीता गेआ ऐ जां नेईं, एह् साढ़े भविष्य च शोध दा विषय होग।
इस कम्मै च इस्तेमाल कीते गेदे सैकरोमाइसिस सेरेविसिया उपभेदें गी तालिका S1 च दित्ता गेआ ऐ । जिंदा कोशिका इमेजिंग आस्तै एससीएलआईएम दे एमएमवाई1583 ते एमएमवाई1635 उपभेदें दा निर्माण डब्ल्यू 303 दी पृष्ठभूमि च कीता गेआ हा। फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग कन्नै Sec13-mCherry गी एक्सप्रेस करने आह् ले इनें उपभेदें गी टेम्पलेट दे रूप च pFA6a प्लाज्मिड कन्नै पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आह् ली विधि दा उपयोग करियै बनाया गेआ हा (23)। GAL1 प्रमोटर दे नियंत्रण च फ्लोरोसेंट प्रोटीन कन्नै लेबल कीते गेदे Mid2-iRFP गी एक्सप्रेस करने आह् ले तनाऽ दा निर्माण इस चाल्लीं कीता गेआ। pKTiRFP-KAN वेक्टर थमां iRFP-KanMx अनुक्रम दा पीसीआर प्रवर्धन (ई. ओ’शी, Addgene प्लाज्मिड नंबर 64687 दा उपहार; http://n2t.net/addgene: 64687; शोध संसाधन पहचानकर्ता (RRID): Addgene_64687) ते अंतर्जात Mid2 दे सी-टर्मिनस च सम्मिलित कीता गेआ। Mid2-iRFP जीनोम अनुक्रम गी प्रवर्धित करने ते GAL1 प्रोमोटर च क्लोन करने दे बाद, इसगी इंटीग्रेशन प्लाज्मिड pRS306 दी Not I-Sac I साइट च इकट्ठा कीता गेआ। नतीजे च प्लाज्मिड pRGS7 गी URA3 लोकस च इकट्ठा करने आस्तै Pst I कन्नै रेखीय कीता गेआ।
Gas1-GFP फ्यूजन जीन सेंट्रोमेर (CEN) प्लाज्मिड च GAL1 प्रोमोटर दे नियंत्रण च व्यक्त कीता जंदा ऐ, जिसदा निर्माण इस चाल्लीं कीता जंदा ऐ। Gas1-GFP अनुक्रम गी pRS416-GAS1-GFP प्लाज्मिड (24) (एल. पोपोलो दा उपहार) थमां पीसीआर द्वारा प्रवर्धित कीता गेआ ते CEN प्लाज्मिड pBEVY-GL LEU2 (सी दा उपहार) दे Xma I–Xho I साइट च क्लोन कीता गेआ। मिलर ने दी; एडजीन प्लाज्मिड नंबर 51225 ऐ; http://n2t.net/addgene: 51225 ऐ; आरआरआईडी: ऐडजीन_51225)। नतीजे च बने दे प्लाज्मिड दा नांऽ pRGS6 रखेआ गेआ। Axl2-GFP फ्यूजन जीन बी pBEVY-GL LEU2 वेक्टर दे GAL1 प्रोमोटर दे नियंत्रण च व्यक्त कीता जंदा ऐ, ते इसदा निर्माण इस चाल्ली ऐ। Axl2-GFP अनुक्रम गी पीसीआर द्वारा pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लाज्मिड (23) थमां प्रवर्धित कीता गेआ हा, ते pBEVY-GL LEU2 वेक्टर दे Bam HI-Pst I साइट च क्लोन कीता गेआ हा। नतीजे च बने दे प्लाज्मिड दा नांऽ pRGS12 रखेआ गेआ। इस अध्ययन च इस्तेमाल कीते गेदे ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स दा अनुक्रम तालिका S2 च दित्ता गेआ ऐ।
इस तनाव गी 0.2% एडेनिन ते 2% ग्लूकोज [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] समृद्ध खमीर अर्क प्रोटीन पी (YP) माध्यम (1 % खमीर अर्क ते 2% प्रोटीन ept) कन्नै पूरक कीता गेआ हा। (YPR)] जां 2% गैलेक्टोज [YP-गैलेक्टोज (YPG)] कार्बन स्रोत दे रूप च, जां सिंथेटिक न्यूनतम माध्यम (0.15% खमीर नाइट्रोजन बेस ते 0.5% अमोनियम सल्फेट) च पोषण आस्तै लोड़चदे उचित अमीनो एसिड ते बेस दे पूरक आस्तै , ते 2% ग्लूकोज (सिंथेटिक ग्लूकोज न्यूनतम माध्यम) जां 2% गैलेक्टोज युक्त (सिंथेटिक गैलेक्टोज न्यूनतम माध्यम) गी कार्बन स्रोत दे रूप च।
रियल-टाइम इमेजिंग आस्तै, GAL1 प्रोमोटर दे हेठ निर्माण गी एक्सप्रेस करने आह् ले तापमान-संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्तन कोशिकाएं गी YPR माध्यम च 24°C पर रातीं दे समें ते मझाटले लॉग चरण च उगाया गेआ। 24 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटें तगर वाईपीजी च प्रेरण दे बाद कोशिकाएं गी 37 डिग्री सेल्सियस पर एसजी च 30 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ, ते फिर स्राव ब्लॉक थमां रिलीज होने आस्तै 24 डिग्री सेल्सियस च स्थानांतरित कीता गेआ। कोशिकाएं गी कांच दी स्लाइड पर ठीक करने आस्तै कोंकनावेलिन ए दा इस्तेमाल कीता गेआ ते एससीएलआईएम द्वारा इमेजिंग कीती गेई। एससीएलआईएम ओलंपस IX-71 उल्टे फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप ते UPlanSApo 100×1.4 संख्यात्मक एपर्चर तेल लेंस (ओलंपस), उच्च गति ते उच्च-सिग्नल-टू-नॉइज अनुपात घूमने आह् ला डिस्क कॉनफोकल स्कैनर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर, ते कस्टम कूलिंग दा संयोजन ऐ सिस्टम दे इमेज इंटेंसाइफायर (हामामात्सु फोटोनिक्स) ×266.7 दे अंतिम आवर्धन कन्नै आवर्धक लेंस प्रणाली ते चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा जेह् ड़ा इलेक्ट्रॉनें गी गुणा करदा ऐ (हमामात्सु फोटोनिक्स) (21) प्रदान करी सकदा ऐ। छवि अधिग्रहण कस्टम सॉफ्टवेयर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) द्वारा कीता जंदा ऐ। 3D छवियें आस्तै, असें उद्देश्य लेंस गी खड़ी रूप कन्नै कंपन करने आस्तै इक कस्टम-मेड पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर दा इस्तेमाल कीता, ते ऑप्टिकल हिस्सें गी इक ढेर च 100 एनएम दे अंतर पर इकट्ठा कीता। जेड-स्टैक छवि गी 3D वोक्सेल डेटा च बदलेआ जंदा ऐ, ते घूमने आह् ली डिस्क कन्फोकल माइक्रोस्कोप आस्तै इस्तेमाल कीते गेदे सैद्धांतिक बिंदु फैलाव फ़ंक्शन दा उपयोग वोलोसिटी सॉफ्टवेयर (पर्किनएलमर) आसेआ डिकॉनवोल्यूशन प्रोसेसिंग आस्तै कीता जंदा ऐ। सह-स्थान विश्लेषण लेई स्वतः थ्रेशोल्ड करने लेई वोलोसिटी सॉफ्टवेयर दा उपयोग करियै, माल समेत ईआरईएस गी मापा गेआ। लाइन स्कैन विश्लेषण मेटामोर्फ सॉफ्टवेयर (मोलेकुलर डिवाइस) दा उपयोग करदे होई कीता गेआ।
सांख्यिकीय महत्व गी निर्धारत करने लेई ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर दा उपयोग करो। दो-पूंछी स्टूडेंट टी-टेस्ट ते साधारण इक-तरफा विश्लेषण दे विचरण (एनओवीए) परीक्षण आस्तै, समूहें दे बश्कार अंतर गी पी <0.05 (*) पर मता असर मन्नेआ जंदा ऐ।
Gas1-GFP दी फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी आस्तै, लॉग फेज कोशिकाएं गी वाईपीडी च रातीं-रात भर उगाया गेआ ते सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै इकट्ठा कीता गेआ, फास्फेट बफर खारा पानी कन्नै दो बारी धोया गेआ, ते बर्फ पर घट्ट शा घट्ट 15 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ, ते फिर माइक्रोस्कोप दे हेठ अग्गें बधी गेआ जि’यां पैह् ले वर्णत कीता गेआ ऐ चेक (24)। अधिग्रहण लेई इक उद्देश्य लेंस, एल 5 (जीएफपी) फिल्टर, हमामात्सु कैमरा ते एप्लीकेशन सूट एक्स (एलएएस एक्स) सॉफ्टवेयर कन्नै लैस लीका डीएमआई8 माइक्रोस्कोप (एचसीएक्स पीएल एपीओ 1003/1.40 तेल पीएच3 सीएस) दा इस्तेमाल कीता गेआ। .
नमूनें गी 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तगर एसडीएस नमूने बफर कन्नै विकृत कीता गेआ, ते उसदे बाद एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (PAGE) कन्नै बक्ख कीता गेआ। इम्यूनोब्लॉटिंग विश्लेषण आस्तै, प्रति लेन 10 μl नमूने गी लोड कीता गेआ। प्राथमिक एंटीबॉडी : खरगोश दे पॉलीक्लोनल एंटी-गैस1 गी 1:3000 दे पतलापन च, खरगोश दे पॉलीक्लोनल एंटी-Emp24 गी 1:500 दे पतलापन च, ते खरगोश दे पॉलीक्लोनल एंटी-जीएफपी (एच. रिज़मैन दा इक उपहार) दा इस्तेमाल 1:3000 दे पतलापन च करो। माउस मोनोक्लोनल एंटी-Pgk1 एंटीबॉडी दा इस्तेमाल 1:5000 (जे. दे ला क्रूज़ थमां इक उपहार) दे पतलापन पर कीता गेआ। सेकेंडरी एंटीबॉडी : हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (HRP) संयुग्मित बकरी एंटी-खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन जी (IgG) दा इस्तेमाल 1:3000 (पियर्स) दे पतलापन च कीता जंदा ऐ । एचआरपी-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी दा इस्तेमाल 1:3000 (पियर्स) दे पतलापन पर कीता गेआ। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्षेत्र गी सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक) दी केमिलुमिनेसेंस विधि कन्नै दिक्खेआ गेआ।
जि’यां (31) च दस्सेआ गेआ ऐ, समृद्ध ईआर अंश पर इक प्राकृतिक इम्यूनोप्रीसिपिटेशन प्रयोग कीता गेआ। संक्षेप च, खमीर कोशिकाएं गी TNE बफर [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड ते प्रोटीज इंहिबिटर मिश्रण) कन्नै 600 nm ( OD600) पर 100 ऑप्टिकल घनत्व पर दो बारी धोओ। इसगी कांच दे मोती कन्नै तोड़ी दित्ता गेआ हा, ते फिर कोशिका दे मलबे ते कांच दे मोती गी सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै हटाई दित्ता गेआ हा। इसदे बाद सुपरनेटेंट गी 17,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ। गोली गी टीएनई च दुबारा लटकाया गेआ ते डिजिटलिस सैपोनिन गी 1% दी अंतिम सांद्रता तगर मिलाया गेआ। निलंबन गी 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाव कन्नै 1 घैंटे तगर इन्क्यूब कीता गेआ, ते उसदे बाद अघुलनशील घटकें गी 13,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूजेशन करियै हटाई दित्ता गेआ। Gas1-GFP इम्यूनोप्रीसिपिटेशन आस्तै, पैह् ले नमूने गी खाली अगरोज बीड्स (ChromoTek) कन्नै 4°C पर 1 घैंटे तगर पूर्व-इन्क्यूबेशन करो, ते फिर GFP-Trap_A (ChromoTek) कन्नै 4°C पर 3 घैंटे तगर इन्क्यूबेशन करो। इम्यूनोप्रेसिपिटेड बीड्स गी 0.2% डाइगोक्सीजेनिन युक्त टीएनई कन्नै पंज बारी धोया गेआ, एसडीएस नमूने बफर कन्नै इल्यूट कीता गेआ, एसडीएस-पीएजी पर बक्ख कीता गेआ, ते इम्यूनोब्लॉटिंग कन्नै विश्लेषण कीता गेआ।
जि’यां (31) च दस्सेआ गेआ ऐ, समृद्ध ईआर अंश पर क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण कीता गेआ। संक्षेप च, समृद्ध ईआर अंश गी 0.5 मिमी डाइथियोबिस (सुक्सीनिमिडाइल प्रोपिओनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए; 20 डिग्री सेल्सियस, 20 मिंट) कन्नै इन्क्यूब कीता गेआ। क्रॉसलिंकिंग रिएक्शन गी ग्लाइसिन (50 मिमी अंतिम सांद्रता, 5 मिनट, 20 डिग्री सेल्सियस) जोड़ियै बुझाया गेआ।
जि’यां पैह् ले वर्णत कीता गेआ ऐ (50), जंगली किस्म दे ते GhLag1 उपभेदें च सेरामाइड दा एमएस विश्लेषण कीता गेआ। संक्षेप च, कोशिकाएं गी 30 डिग्री सेल्सियस पर वाईपीडी च घातीय चरण (3 थमां 4 ओडी600 इकाइयें/एमएल) तगर बधाया गेआ हा, ते 25×107 कोशिकाएं गी कट्टेआ गेआ हा। इंदी चयापचय ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड कन्नै बुझी जंदी ऐ । निष्कर्षण विलायक [इथेनॉल, पानी, ईथर, पाइरिडीन ते 4.2 एन अमोनियम हाइड्रोक्साइड (15:15:5:1:0.018 v/v)] ते आंतरिक मानक C17 सेरामाइड (860517, अवंटी ध्रुवीय लिपिड) गुणवत्ता दा 1.2 एनएमओएल) दा इस्तेमाल करो। अर्क दा हल्के क्षारीय जलविघटन करने आस्तै मोनोमिथाइलमाइन अभिकर्मक [मेथानॉल, पानी, एन-ब्यूटानॉल ते मिथाइलमाइन घोल (4:3:1:5 v/v)] दा इस्तेमाल करो, ते फिर नमक मुक्त करने आस्तै पानी कन्नै संतृप्त एन-ब्यूटानॉल दा इस्तेमाल करो। आखरी च, अर्क गी सकारात्मक मोड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथानॉल/पानी (2:7:1) + 5 मिमी अमोनियम एसीटेट] च फिरी लटकाया गेआ ते मास स्पेक्ट्रोमीटर च ​​इंजेक्ट कीता गेआ। स्फिंगोलिपिड अणुएं दी पन्छान ते मात्रा निर्धारण आस्तै बहु-प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) कीती गेई। टीएसक्यू वैंटेज तृतीयक चतुर्ध्रुवीय मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) लिपिड विश्लेषण आस्तै रोबोट नैनोफ्लो आयन स्रोत नैनोमेट एचडी (एडविओन बायोसाइंसेज, इथाका, एनवाई) कन्नै लैस ऐ। टक्कर ऊर्जा हर सेरामाइड श्रेणी आस्तै अनुकूलित कीती जंदी ऐ। एमएस डेटा सकारात्मक मोड च हासल कीता गेआ। हर इक जैविक प्रतिकृति आस्तै लिपिड संकेत त्रै स्वतंत्र मापने दा माध्य ऐ ।
जि’यां (31) च दस्सेआ गेआ ऐ, गैस 1-जीएफपी गी एक्सप्रेस करने आह् ली कोशिकाएं (800×107) गी प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन दे अधीन कीता गेआ। शुद्ध गैस1-जीएफपी गी एसडीएस-पीएजी द्वारा अलग कीता गेआ ते इक पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली च स्थानांतरित कीता गेआ। प्रोटीन गी पीवीडीएफ गी एमाइड ब्लैक कन्नै रंगने कन्नै दिक्खेआ गेआ। Gas1-GFP बैंड गी पीवीडीएफ थमां कट्टियै 5 बारी मिथानल कन्नै ते इक बारी तरल क्रोमैटोग्राफी-एमएस (एलसी-एमएस) ग्रेड पानी कन्नै धोया गेआ। झिल्ली पट्टी गी 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफर ते 500μl ताजा घुलने आह् ले 1 M सोडियम नाइट्राइट मिश्रण कन्नै 37°C पर 3 घैंटे तगर इन्क्यूबेशन करियै, लिपिड अंश गी गैस1-GFP थमां रिलीज कीता जंदा ऐ ते ग्लूकोसामाइन ते इनोसिटोल (51) दे बश्कार इनोसाइने फास्फेट सेरामाइड दी रिलीज गी लाइज कीता जंदा ऐ। इसदे बाद झिल्ली दी पट्टी गी एलसी-एमएस ग्रेड दे पानी कन्नै चार बारी धोया गेआ, कमरे दे तापमान पर सुक्खेआ गेआ, ते विश्लेषण तगर -80 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन वातावरण च संग्रहीत कीता गेआ। नियंत्रण दे तौर पर हर प्रयोग लेई पीवीडीएफ झिल्ली दा इक खाली नमूना इस्तेमाल कीता गेआ। इसदे बाद Gas1-GFP थमां कड्ढे गेदे लिपिड दा एमएस द्वारा विश्लेषण कीता गेआ जि’यां वर्णत कीता गेआ ऐ ( 50 )। संक्षेप च, जीपीआई-लिपिड युक्त पीवीडीएफ पट्टियें गी 75μl नकारात्मक मोल्ड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथानॉल (1:2) + 5 एमएम अमोनियम एसीटेट] च फिरी लटकाया गेआ ते इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई)-एमआरएम/एमएस स्फिंगोलिपिड प्रजातियें दा विश्लेषण (टीएसक्यू वैंटेज) पास कीता गेआ। इस मामले च एमएस डेटा नेगेटिव आयन मोड च हासल कीता गेआ।
जि’यां पैह् ले आखेआ गेआ ऐ, जीपीआई एंकर दा लिपिड हिस्सा [3H]-इनोसिटोल-लेबल जीपीआई-एपी (16) थमां बक्ख कीता गेआ हा। लिपिड गी विलायक प्रणाली (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मेथानॉल-0.25% केसीएल) दा उपयोग करियै पतली परत क्रोमैटोग्राफी कन्नै बक्ख कीता गेआ ते एफएलए-7000 (फुजीफिल्म) दा उपयोग करियै विज़ुअलाइज़ कीता गेआ।
Gas1-GFP (600×107) गी एक्सप्रेस करने आह् ले कोशिकाएं गी TNE बफर कन्नै TNE बफर कन्नै दो बारी धोया गेआ हा, ते कांच दे मोती कन्नै तोड़ेआ गेआ हा, ते फिर कोशिकाएं दे मलबे ते कांच दे मोती गी हटाने आस्तै सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ हा। इसदे बाद सुपरनेटेंट गी 17,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटे तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ। गोली गी टीएनई च धोया गेआ ते 1 यू पीआई-पीएलसी (इन्विट्रोजन) कन्नै टीएनई च 0.2% डिजिटलिस सैपोनिन युक्त टीएनई च 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटे तगर इन्क्यूब कीता गेआ। एन्जाइम दे इलाज दे बाद झिल्ली गी 17,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटे तगर सेंट्रीफ्यूज करियै हटाई दित्ता गेआ। Gas1-GFP गी इम्यूनोप्रेसिपिटेट करने आस्तै, सुपरनेटेंट गी GFP-Trap_A (ChromoTek) कन्नै 4°C पर रात भर इन्क्यूब कीता गेआ। एसडीएस-पीएजी द्वारा अलग कीते गेदे शुद्ध गैस1-जीएफपी गी कूमासी शानदार नीले रंग कन्नै दाग दित्ता गेआ। Gas1-GFP धुंधलापन बैंड गी एक्वाडक्ट दे आसपास दे ग्रे थमां कट्टी दित्ता गेआ हा, ते फिर आयोडोएसीटामाइड कन्नै अल्काइलेशन ते डाइथियोथ्राइटोल कन्नै रिडक्शन दे बाद, ट्रिप्सिन कन्नै इन-जेल पाचन कीता गेआ। जीपीआई-ग्लाइकैन कन्नै ट्रिप्टिक पेप्टाइड ते पेप्टाइड्स गी निष्कर्षण ते सुक्खना। सूखे पेप्टाइड गी 20 μl पानी च घोल दित्ता गेआ। एलसी च इक हिस्सा (8μl) इंजेक्ट करो। विशिष्ट ढाल परिस्थितियें च पेप्टाइड्स गी बक्ख करने आस्तै इक ओक्टाडेसिलसिलेन (ओडीएस) स्तंभ (डेवेलोसिल 300ओडीएस-एचजी-5; अंदरूनी व्यास 150 मिमी × 1.0 मिमी; नोमुरा केमिकल, ऐची प्रांत, जापान) दा इस्तेमाल कीता गेआ। मोबाइल चरण विलायक ए (0.08% फार्मिक एसिड) ते विलायक बी (80% एसीटोनिट्राइल च 0.15% फार्मिक एसिड) ऐ। एक्सेला एचपीएलसी प्रणाली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, बोस्टन, मैसाचुसेट्स) दा इस्तेमाल कीता गेआ तां जे 55 मिंटें दे अंदर 55 मिंटें दे अंदर विलायक ए कन्नै स्तंभ गी 50 μl min-1 दी प्रवाह दर कन्नै 5 मिनट तगर इल्यूट कीता गेआ, ते उसदे बाद विलायक बी दी सांद्रता गी 40% तगर बधाया गेआ। , संयुक्त राज्य अमेरिका)। इल्यूएट गी ईएसआई आयन स्रोत च लगातार पेश कीता गेआ हा, ते जीपीआई-ग्लाइकैन कन्नै ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स ते पेप्टाइड्स दा विश्लेषण एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल (हाइब्रिड रेखीय आयन ट्रैप-ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर; थर्मो फिशर साइंटिफिक) कन्नै कीता गेआ। एमएस सेटअप च केशिका स्रोत दा वोल्टेज 4.5 केवी पर सेट कीता गेआ हा, ते स्थानांतरण केशिका दा तापमान 300 डिग्री सेल्सियस पर रक्खेआ गेआ हा। केशिका वोल्टेज ते ट्यूब लेंस वोल्टेज गी क्रमशः 15 वी ते 50 वी पर सेट कीता गेआ। एमएस डेटा 300/एम/जेड द्रव्यमान/चार्ज अनुपात (एम/जेड) 3000 दी द्रव्यमान रेंज च सकारात्मक आयन मोड (60,000 दा रिजोल्यूशन; 10 भाग प्रति मिलियन दी द्रव्यमान सटीकता) च हासल कीता गेआ हा।एमएस/एमएस डेटा एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल च आयन ट्रैप दे माध्यम कन्नै हासल कीता जंदा ऐ [पैह्ले 3 अंक जिंदे उप्पर डेटा निर्भर करदा ऐ, टक्कर पैदा विघटन (सीआईडी)] दा।
एमडी सिमुलेशन ग्रोमैक्स (52) सॉफ्टवेयर ते मार्टिनी 2 फोर्स फील्ड (53-55) दा उपयोग करदे होई कीते गे। इसदे बाद CHARMM GUI झिल्ली बिल्डर (56, 57) दा इस्तेमाल डायोलियोइलफॉस्फेटिडाइलकोलाइन (DOPC) ते Cer C18 जां DOPC ते Cer C26 आह् ली द्विपरत परत बनाने लेई कीता गेआ। Cer C26 दी टोपोलॉजी ते निर्देशांक स्फिंगोसिन पूंछ थमां अतिरिक्त मोती गी हटाइयै DXCE थमां हासल कीते जंदे न। डबल लेयर गी संतुलित करने ते इसगी चलाने लेई हेठ दित्ती गेदी प्रक्रिया दा उपयोग करो, फिर Emp24 आह् ला सिस्टम बनाने लेई सिस्टम दे आखरी निर्देशांक दा इस्तेमाल करो. खमीर Emp24 (अवशेष 173 थमां 193) दे ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन गी विजुअल एमडी (वीएमडी) उपकरण आणविक संरचना ( 58 ) दा उपयोग करदे होई α-हेलिक्स दे रूप च बनाया गेआ हा। फिर, ओवरलैपिंग लिपिड गी हटाने दे बाद, प्रोटीन गी मोटे दानेदार बनाया गेआ ते CHARMM GUI दा उपयोग करियै द्विपरत च पाया गेआ। अंतिम प्रणाली च 1202 डीओपीसी ते 302 सेर सी26 जां 1197 डीओपीसी ते 295 सेर सी18 ते ईम्प24 होंदे न। सिस्टम गी 0.150M दी सांद्रता तगर आयनीकरण करो। दो द्विपरत रचनाएं लेई चार स्वतंत्र प्रतिकृतियां बनाईयां गेइयां।
लिपिड द्विपरत परत गी CHARMM GUI प्रक्रिया दा उपयोग करियै संतुलित कीता जंदा ऐ, जिस च 405,000 कदमें गी घट्ट करने ते फिर संतुलित करना शामल ऐ, जित्थै स्थिति दी बाधाएं गी धीरे-धीरे घट्ट कीता जंदा ऐ ते खत्म कीता जंदा ऐ, ते समें दे कदम गी 0.005 पीएस थमां 0.02 पीएस तगर बधाया जंदा ऐ। संतुलन दे बाद, एह् 0.02 पीएस दे समें कदम कन्नै 6 μs पैदा करदा ऐ। Emp24 गी सम्मिलित करने दे बाद, सिस्टम गी घट्ट करने ते संतुलित करने आस्तै उस्सै CHARMM GUI प्रक्रिया दा इस्तेमाल करो, ते फ्ही उत्पादन च 8 s तगर चलाओ.
सारे प्रणालियें आस्तै, संतुलन प्रक्रिया दे दौरान, दबाव गी बेरेंडसन बैरोस्टैट (59) कन्नै नियंत्रत कीता जंदा ऐ, ते उत्पादन प्रक्रिया दे दौरान, दबाव गी परिनेलो-रहमान बैरोस्टैट (60) आसेआ नियंत्रित कीता जंदा ऐ। सारे मामलें च औसत दबाव 1 बार होंदा ऐ ते अर्ध-समरूप दबाव युग्मन योजना दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ। संतुलन ते उत्पादन प्रक्रिया च, क्रमशः प्रोटीन, लिपिड ते विलायक कणें दे तापमान गी जोड़ने आस्तै गति पुनर्मापन कन्नै थर्मास्टेट (61) दा उपयोग कीता जंदा ऐ। पूरे ऑपरेशन दौरान लक्ष्य तापमान 310K ऐ। गैर-बॉन्डिंग परस्पर क्रिया दी गणना 0.005 बफर सहिष्णुता कन्नै वर्लेट योजना दा उपयोग करियै इक जोड़ीदार सूची पैदा करियै कीती जंदी ऐ। कूलम्ब पद दी गणना रिएक्शन फील्ड ते 1.1 एनएम दी कट-ऑफ दूरी दा उपयोग करियै कीती जंदी ऐ। वैंडर वाल्स शब्द 1.1 एनएम दी कट-ऑफ दूरी आह् ली कट-ऑफ योजना दा उपयोग करदा ऐ, ते वर्लेट कट-ऑफ योजना दा इस्तेमाल संभावित बहाव आस्तै कीता जंदा ऐ (62)।
वीएमडी दा उपयोग करदे होई डीओपीसी फास्फेट बीड्स जां सेरामाइड एएम1 बीड्स ते प्रोटीन दे बश्कार कटऑफ तरंगदैह् क 0.7 एनएम ऐ, ते प्रोटीन कन्नै परस्पर क्रिया करने आह् ले लिपिड दी संख्या दी गणना कीती जंदी ऐ। निम्नलिखित सूत्र दे अनुसार, (63) दे अनुसार डिप्लीशन-एन्रिचमेंट (डीई) कारक दी गणना करो: डीई कारक = (प्रोटीन च कुल लिपिड दी मात्रा 0.7) प्रोटीन च 0.7 (कुल लिपिड च Cer दी मात्रा)
रिपोर्ट कीता गेदा मूल्य औसतन दे रूप च हासल कीता जंदा ऐ, ते त्रुटि बार एसई दी चार स्वतंत्र प्रतियां न। डीई कारक दे सांख्यिकीय महत्व दी गणना टी परीक्षण [(औसतडीई-कारक-1)/एसई] द्वारा कीती जंदी ऐ। इक पूंछ बंड थमां पी मान दी गणना करो।
ट्रेस दे पिछले 250 एनएस दे अंदर Emp24 युक्त सिस्टम दे 2D पार्श्व घनत्व नक्शे दी गणना करने लेई GROMACS उपकरण दा इस्तेमाल कीता गेआ। सेरामाइड दे समृद्धि/क्षय नक्शा हासल करने आस्तै, Cer दे घनत्व नक्शे गी Cer ते DOPC दे नक्शे दे योग कन्नै विभाजित कीता जंदा ऐ, ते उसदे बाद शरीर च Cer दी सांद्रता कन्नै विभाजित कीता जंदा ऐ। उसी रंग नक्शा पैमाने दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ।
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एह् इक खुल्लै एक्सेस लेख ऐ जेह् ड़ा क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-व्यावसायिक लाइसेंस दी शर्तें दे तैह् त बंड कीता गेदा ऐ, जेह् ड़ा कुसै बी माध्यम च इस्तेमाल, वितरण ते प्रजनन दी अनुमति दिंदा ऐ, जदूं तगर अंतिम इस्तेमाल व्यावसायिक फायदे आस्तै नेईं ऐ ते आधार ऐ जे मूल कम्मै दा सही ऐ। हवाला।
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इस सवाल दा इस्तेमाल इस गल्लै गी परखने लेई कीता जंदा ऐ जे तुस विजिटर ओ जां नेईं ते स्वचालित स्पैम जमा करने गी रोकने लेई कीता जंदा ऐ।
सोफिया रोड्रिग्ज-गैलार्डो, काज़ूओ कुरोकावा, सुसाना सबिडो-बोजो, अलेजांड्रो कोर्टेज · गोमेज़ (अलेक्जेंडर कोर्टेस-गोमेज़), अत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेदा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), ऑक्सीलिडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकीरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नकानो, मैनुअल मुनिज
3D उच्च रिजोल्यूशन रियल-टाइम इमेजिंग चयनात्मक आउटपुट साइटें च प्रोटीन छंटाई आस्तै सेरामाइड श्रृंखला दी लंबाई दा महत्व दस्सदी ऐ।
सोफिया रोड्रिग्ज-गैलार्डो, काज़ूओ कुरोकावा, सुसाना सबिडो-बोजो, अलेजांड्रो कोर्टेज · गोमेज़ (अलेक्जेंडर कोर्टेस-गोमेज़), अत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेदा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), ऑक्सीलिडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकीरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नकानो, मैनुअल मुनिज
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