वर्तमान *वर्तमान पता: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन एक्सीलेंस क्लस्टर रिसर्च ऑन सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया पर बुढ़ापे कन्नै सरबंधत रोगें (सीईसीएडी)।
माइटोकॉन्ड्रिया दी बमारियें दे न्यूरोडीजनरेशन गी अपरिवर्तनीय मन्नेआ जंदा ऐ की जे न्यूरॉन्स दी चयापचय प्लास्टिक दी क्षमता सीमित ऐ , पर शरीर च न्यूरॉन चयापचय दी कोशिका स्वायत्तता उप्पर माइटोकॉन्ड्रिया दी विकार दा प्रभाव घट्ट समझेआ गेआ ऐ इत्थें, अस बाधित माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूजन गतिशीलता दे कारण प्रगतिशील OXPHOS दी कमी कन्नै पुर्किन्जे न्यूरॉन्स दे कोशिका-विशिष्ट प्रोटीओम दा परिचय दिंदे न। असें गी पता चलेआ जे माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी ने प्रोटीओमिक्स दे क्षेत्र च इक गहरा बदलाव शुरू कीता ऐ, जिसदे फलस्वरूप अंततः कोशिकाएं दी मौत थमां पैह्ले सटीक चयापचय कार्यक्रमें दी क्रमबद्ध सक्रियता होंदी ऐ । अप्रत्याशित रूप कन्नै, असें पाइरूवेट कार्बोक्जिलेज (पीसीएक्स) ते टीसीए चक्र दे बिचौलियें दे पूरक आहार कन्नै सरबंधत होर पेरोक्साइडेज दी स्पष्ट प्रेरण निर्धारत कीती। पीसीएक्स दे निरोध कन्नै ऑक्सीडेटिव तनाव ते न्यूरोडीजनरेशन गी बधाया गेआ ऐ, जेह्ड़ा इस गल्लै गी दस्सा करदा ऐ जे एथेरोस्क्लेरोसिस दा आक्सीजन दे कमी आह्ले न्यूरॉन्स च सुरक्षात्मक प्रभाव होंदा ऐ । अंतिम रूप कन्नै क्षीण न्यूरॉन्स च माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूजन दी बहाली कन्नै इनें चयापचय विशेषताएं गी पूरी चाल्लीं उल्टा करी दित्ता जंदा ऐ , जिस कन्नै कोशिकाएं दी मौत गी रोकेआ जंदा ऐ । साढ़े निष्कर्ष पैह् ले थमां गै अनजान रस्ते दी पंछान करदे न जेह्ड़े माइटोकॉन्ड्रिया दे विकारें गी लचीलापन प्रदान करदे न ते एह् दस्सदे न जे न्यूरोडीजनरेशन गी बीमारी दे अंतिम चरणें च बी उल्टा कीता जाई सकदा ऐ ।
न्यूरॉन ऊर्जा चयापचय गी बनाए रखने च माइटोकॉन्ड्रिया दी केंद्रीय भूमिका गी मनुक्खी माइटोकॉन्ड्रिया दे रोगें कन्नै जुड़े दे व्यापक न्यूरोलॉजिकल लक्षणें कन्नै जोर दित्ता जंदा ऐ । इनें बमारियें च मते सारे जीन उत्परिवर्तन कन्नै पैदा होंदे न जेह्ड़े माइटोकॉन्ड्रिया जीन एक्सप्रेसन (1, 2) जां माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता कन्नै सरबंधत जीन विनाश गी नियंत्रत करदे न, जेह्ड़े अप्रत्यक्ष रूप कन्नै माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (mtDNA) दी स्थिरता गी प्रभावित करदे न (3, 4) जानवरें दे माडल च कम्म करने कन्नै पता चलेआ ऐ जे आसपास दे ऊतकें च माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी दे जवाब च रूढ़िवादी चयापचय मार्ग (5-7) सक्रिय कीते जाई सकदे न , जिस कन्नै इनें जटिल रोगें दे रोगजनन दे बारे च महत्वपूर्ण जानकारी दित्ती जंदी ऐ इसदे बिल्कुल विपरीत, मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया एडेनोसाइने ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन दी सामान्य विफलता दे कारण विशिष्ट कोशिकाएं दे किस्में दे चयापचय च बदलाव दी साढ़ी समझ बुनियादी ऐ (8), चिकित्सकीय लक्ष्यें दी पन्छान करने दी लोड़ उप्पर जोर दिंदा ऐ जेह्दे कन्नै बीमारी गी रोकने जां रोकने च इस्तेमाल कीता जाई सकदा ऐ न्यूरोडिजनरेशन गी रोकना (9)। जानकारी दी कमी एह् तथ्य ऐ जे तंत्रिका कोशिकाएं गी व्यापक रूप कन्नै आसपास दे ऊतकें दे कोशिकाएं दे किस्में दे मुकाबले च चयापचय दी लचीलापन बड़ा सीमित मन्नेआ जंदा ऐ ( 10 ) । एह् दिक्खदे होई जे एह् कोशिकाएं सिनैप्टिक संचरण गी बढ़ावा देने ते चोट ते बीमारी दी स्थिति च प्रतिक्रिया देने आस्तै न्यूरॉन्स गी मेटाबोलाइट्स दी आपूर्ति दा समन्वय करने च केंद्रीय भूमिका निभांदे न , मस्तिष्क दे ऊतक दे चुनौतीपूर्ण स्थितियें च कोशिका चयापचय गी अनुकूल बनाने दी क्षमता लगभग ग्लिया कोशिकाएं तकर सीमित ऐ ( 11-14 ) इसदे अलावा, मस्तिष्क दे ऊतक दी निहित कोशिका विषमता काफी हद तकर चयापचय परिवर्तन दे अध्ययन च बाधा पांदी ऐ जेह्ड़े विशिश्ट न्यूरॉन उप-समूहें च होंदे न । नतीजतन, न्यूरॉन्स च माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी दे सटीक कोशिका ते चयापचय दे नतीजें दे बारे च मता नेईं जानदे न ।
माइटोकॉन्ड्रिया दे विकार दे चयापचय दे नतीजें गी समझने आस्तै, असें माइटोकॉन्ड्रिया बाहरी झिल्ली संलयन (Mfn2) दे विनाश दे कारण न्यूरोडीजनरेशन दे बक्ख-बक्ख चरणें च पुर्किन्जे न्यूरॉन्स (पीएन) गी अलग कीता। हालांकि मनुक्खें च Mfn2 उत्परिवर्तन वंशानुगत मोटर संवेदी न्यूरोपैथी दे इक रूप कन्नै जुड़े दा ऐ जेह्ड़ा चारकोट-मैरी-टूथ टाइप 2A (15) दे रूप च जानेआ जंदा ऐ, पर चूहें च Mfn2 दा सशर्त विनाश आक्सीजन फास्फोरिलेशन (OXPHOS) विकार विधि दा इक अच्छी तरह कन्नै मान्यता प्राप्त प्रेरण ऐ बक्ख-बक्ख न्यूरॉन उप-प्रकार (16-19) ते नतीजे च न्यूरोडिजनरेटिव फेनोटाइप दे कन्नै-कन्नै प्रगतिशील न्यूरोलॉजिकल लक्षण, जि’यां गतिशीलता विकार (18, 19) जां सेरेब्रल अटैक्सिया (16) होंदे न लेबल-मुक्त मात्रात्मक (LFQ) प्रोटीओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिंग, ते वायरस दे तरीकें दे संयोजन दा उपयोग करियै, अस दस्सने आं जे प्रगतिशील न्यूरोडिजनरेशन मजबूती कन्नै पाइरुवेट कार्बोक्जिलेज (PCx) ते होर कारकें गी प्रेरित करदा ऐ जेह्ड़े विवो च पीएनएस दे धमनीकाठिन्य च शामल एन्जाइमें दी अभिव्यक्ति। इस खोज दी प्रासंगिकता गी सत्यापन करने आस्तै, असें खास तौर उप्पर Mfn2 दी कमी आह्ले पीएन च पीसीएक्स दी अभिव्यक्ति गी डाउन-रेगुलेट कीता, ते पाया जे इस आपरेशन ने ऑक्सीडेटिव तनाव गी बधाया ते न्यूरोडिजनरेशन गी तेज कीता, इस चाल्लीं साबित कीता गेआ ऐ जे एजोस्पर्मिया कोशिका दी मौत च चयापचय अनुकूलन क्षमता प्रदान करदा ऐ। MFN2 दी गंभीर अभिव्यक्ति गंभीर OXPHOS दी कमी, माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए दी बड्डी खपत, ते प्रतीत होने आह्ले टूटे दे माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क कन्नै टर्मिनल डिजनरेशन पीएन गी पूरी चाल्लीं बचाई सकदी ऐ, जेह्ड़ा इस गल्लै पर होर जोर दिंदा ऐ जे न्यूरोडिजनरेशन दा एह् रूप कोशिका दी मौत थमां पैह्ले बीमारी दे उन्नत चरण च बी ठीक होई सकदा ऐ
Mfn2 नॉकआउट पीएनएस च माइटोकॉन्ड्रिया गी दिक्खने आस्तै, असें इक माउस तनाव दा इस्तेमाल कीता जेह् ड़ा Cre-निर्भर माइटोकॉन्ड्रिया गी पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्ति गी निशाना बनाने दी अनुमति दिंदा ऐ ते विवो च माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान दी जांच कीती। असें गी पता चलेआ जे पीएनएस च Mfn2 जीन दे विनाश कन्नै माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क दा धीरे-धीरे विभाजन होग (चित्र S1A), ते सबनें थमां पैह्ले बदलाव 3 हफ्ते दी उम्र च पाया गेआ। इसदे बरोबर, पीएन कोशिका परत दा काफी क्षय, जिसी कैलबिंडिन इम्यूनोस्टेनिंग दे नुकसान दा सबूत ऐ, 12 हफ्ते दी उम्र तकर शुरू नेईं होंदा हा (चित्र 1, ए ते बी) । माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान च शुरूआती बदलाव ते न्यूरॉन दी मौत दी दृष्टिगोचर शुरूआत दे बश्कार समें दे बेमेल ने असेंगी कोशिका दी मौत थमां पैह्ले माइटोकॉन्ड्रिया दी विकार कन्नै शुरू कीते गेदे चयापचय परिवर्तनें दी जांच करने लेई प्रेरित कीता। अस वाईएफपी (वाईएफपी +)-अभिव्यक्त पीएन (चित्र 1 सी) गी अलग करने आस्तै इक प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिका छंटाई (एफएसीएस)-आधारत रणनीति विकसित कीती, ते नियंत्रण चूहों (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), जिसगी इसदे बाद सीटीआरएल (चित्र S1B) दे रूप च संदर्भित कीता जंदा ऐ। वाईएफपी संकेत दी सापेक्ष तीव्रता दे आधार उप्पर गेटिंग रणनीति दा अनुकूलन असेंगी गैर-पीएन (वाईएफपीनेग) (चित्र S1B) जां कथित फ्लोरोसेंट एक्सोन/डेंड्रिटिक टुकड़े (YFPlow; चित्रा S1D, बाएं) थमां पीएन दे YFP + शरीर (YFPhigh) गी शुद्ध करने दी अनुमति दिंदा ऐ, जिसदी पुष्टि कन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्र S1D, दाएं) कन्नै कीती गेई ऐ। वर्गीकृत आबादी दी पन्छान गी सत्यापन करने आस्तै, असें एलएफक्यू प्रोटीओमिक्स ते फिर प्रधान घटक विश्लेषण कीता, ते पाया जे YFPhigh ते YFPneg कोशिकाएं दे बश्कार इक साफ बक्खरापन ऐ (चित्र S1C)। YFPhigh कोशिकाएं च ज्ञात पीएनएस मार्करें (यानी Calb1, Pcp2, Grid2 ते Itpr3) (21, 22) दा शुद्ध समृद्धि दिक्खी गेई, पर आमतौर पर न्यूरॉन्स जां होर कोशिकाएं दे किस्में च व्यक्त कीते गेदे प्रोटीन दा कोई समृद्धि नेईं दिक्खी गेई (चित्र 1D) स्वतंत्र प्रयोगें च इकट्ठे कीते गेदे वर्गीकृत YFPhigh कोशिकाएं च नमूनें दे बश्कार इक तुलना च इक सहसंबंध गुणांक> 0.9 दिक्खेआ गेआ, जेह्ड़ा जैविक प्रतिकृतियें दे बश्कार अच्छी प्रजनन क्षमता दा प्रदर्शन करदा ऐ (चित्र S1E)। संक्षेप च, इनें आंकड़ें ने संभव पीएन दे तीव्र ते विशिष्ट अलगाव आस्तै साढ़ी योजना गी प्रमाणत कीता। क्योंकि इस्तेमाल कीती गेदी L7-cre ड्राइवर प्रणाली प्रसव दे बाद पैह्ले हफ्ते च मोज़ेक पुनर्संयोजन गी प्रेरित करदी ऐ (23), अस CTRL ते सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरॉन्स इकट्ठा करने थमां चूहें गी कटाई करना शुरू कीता। पुनर्संयोजन पूरा होने दे बाद 4 हफ्ते दी उम्र च इसगी Mfn2cKO आखेआ जंदा ऐ । अंत बिंदु दे रूप च, असें 8 हफ्ते दी उम्र दा चयन कीता जिसलै पीएन परत स्पष्ट माइटोकॉन्ड्रिया दे टुकड़े दे बावजूद बी बरकरार ही (चित्र 1 बी ते चित्रा S1A)। कुल मिलाइयै, असें कुल 3013 प्रोटीनें दी मात्रा निर्धारित कीती, जिंदे चा लगभग 22% माइटोकॉन्ड्रिया दे रूप च माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीओम दे आधार उप्पर माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशनें पर आधारित हे (चित्र 1 ई) (चित्र 1 ई) (24)। हफ्ते 8 च कीते गेदे विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण च एह् दिक्खेआ गेआ ऐ जे सारे प्रोटीनें च सिर्फ 10.5% च मता बदलाव दिक्खेआ गेआ ऐ (चित्र 1F ते चित्रा S1F), जिंदे चा 195 प्रोटीन डाउन-रेगुलेटेड ते 120 प्रोटीन अप-रेगुलेटेड हे (चित्र 1F)। ध्यान देने आह् ला ऐ जे इस डेटा सेट दा "नवाचार मार्ग विश्लेषण" दस्सदा ऐ जे विभेदक रूप कन्नै अभिव्यक्त जीन मुक्ख रूप कन्नै विशिश्ट चयापचय मार्गें दे इक प्रतिबंधित सेट कन्नै सरबंधत न (चित्र 1 जी) मजेदार गल्ल एह् ऐ जे हालांकि OXPHOS ते कैल्शियम सिग्नलिंग कन्नै सरबंधत रस्ते दा डाउन-रेगुलेशन फ्यूजन दी कमी आह्ले पीएन च माइटोकॉन्ड्रिया दी विकार दे प्रेरण दी पुष्टि करदा ऐ , पर दूई श्रेणियां जेह्ड़ियां मुख्य रूप कन्नै अमीनो एसिड चयापचय कन्नै जुड़ी दियां न , काफी हद तकर अप-रेगुलेट होंदे न , जेह्ड़ा माइटोकॉन्ड्रिया पीएनए च होने आह्ले चयापचय दे अनुरूप ऐ रिवायरिंग लगातार होंदी ऐ। विकार हो जाना।
(ए) सीटीआरएल ते Mfn2cKO चूहें दे सेरेब्रल खंडें दे प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफें च पीएनएस (कैल्बिंडिन, ग्रे) दा प्रगतिशील नुकसान दिक्खेआ जंदा ऐ; नाभिक गी डीएपीआई कन्नै काउंटरस्टेन कीता गेआ। (बी) (ए) दी मात्रा निर्धारण (विचरण दा इक तरफा विश्लेषण, *** पी <0.001; एन = त्रै चूहों थमां 4 थमां 6 घेरे)। (ग) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह। (D) पुर्किन्जे (ऊपर) ते होर कोशिकाएं दे किस्में (मध्य) आस्तै विशिश्ट मार्करें दा हीट मैप बंड। (ई) वर्गीकृत पीएन च चिह्नित माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन दी संख्या गी दस्सने आह् ला वेन आरेख। (F) 8 हफ्ते च Mfn2cKO न्यूरॉन्स च विभेदक रूप कन्नै अभिव्यक्त प्रोटीन दा ज्वालामुखी प्लाट (1.3 दा महत्व कट-ऑफ मूल्य)। (जी) रचनात्मकता मार्ग विश्लेषण 8 हफ्ते दे रूप च वर्गीकृत Mfn2cKO पीएन च पंज सारें शा मते महत्व आह् ले अप-रेगुलेशन (लाल) ते डाउन-रेगुलेशन (नीले) मार्गें गी दस्सदा ऐ। हर इक पता लाए गेदे प्रोटीन दे औसत अभिव्यक्ति स्तर गी दस्सेआ गेआ ऐ। ग्रेस्केल गर्मी नक्शा: समायोजित पी मान। ns, महत्वपूर्ण नहीं।
प्रोटीओमिक्स दे आंकड़े च दस्सेआ गेआ ऐ जे परिसर I, III, ते IV दी प्रोटीन अभिव्यक्ति च धीरे-धीरे कमी आई ऐ। परिसर I, III, ते IV सारें च जरूरी mtDNA-एन्कोडेड उप-इकाइयां शामल हे, जदके परिसर II, जेह् ड़ा सिर्फ परमाणु-कोडेड हा, मूल रूप कन्नै अप्रभावित हा (चित्र 2 ए ते चित्रा S2A)। . प्रोटीओमिक्स दे नतीजें दे अनुरूप, सेरेब्रल ऊतक खंडें दी इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री ने दस्सेआ जे पीएन च परिसर IV दे MTCO1 (माइटोकॉन्ड्रिया साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज सब-यूनिट 1) सब-यूनिट स्तर च धीरे-धीरे कमी आई ऐ (चित्र 2 बी) mtDNA-एन्कोडेड सब-यूनिट Mtatp8 च काफी कमी आई ही (चित्र S2A), जदके परमाणु-एन्कोडेड एटीपी सिंथेज सब-यूनिट दा स्थिर-स्थिति स्तर अपरिवर्तित रेहा, जेह्ड़ा ज्ञात स्थिर एटीपी सिंथेज सब-एसेम्बली F1 परिसर कन्नै मेल खंदा ऐ जिसलै mtDNA अभिव्यक्ति स्थिर होंदी ऐ। गठन लगातार होंदा ऐ। टोक दे (7)। रियल-टाइम पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा छंटाई कीते गेदे Mfn2cKO पीएन च mtDNA दे स्तर दा मूल्यांकन करियै mtDNA दी नकल संख्या च धीरे-धीरे कमी दी पुष्टि कीती गेई। नियंत्रण समूह दी तुलना च 8 हफ्ते दी उम्र च mtDNA दे स्तर दा लगभग 20% गै बरकरार रेहा (चित्र 2C) । इनें नतीजें दे अनुरूप, डीएनए दा पता लाने आस्तै Mfn2cKO पीएनएस दी कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी धुंधलापन माइटोकॉन्ड्रिया न्यूक्लियोटाइड्स दी समें-निर्भर खपत गी दस्सदा ऐ (चित्र 2 डी)। असें गी पता चलेआ जे माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन दे गिरावट ते तनाव प्रतिक्रिया च शामल सिर्फ किश उम्मीदवारें गी अप-रेगुलेट कीता गेआ ऐ, जिंदे च Lonp1, Afg3l2 ते Clpx, ते OXPHOS जटिल असेंबली कारक शामल न। एपोप्टोसिस च शामल प्रोटीन दे स्तर च कोई खास बदलाव नेईं दिक्खेआ गेआ (चित्र S2B) । इसी गै असें गी पता चलेआ जे कैल्शियम परिवहन च शामल माइटोकॉन्ड्रिया ते एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम चैनलें च सिर्फ मामूली बदलाव होंदा ऐ (चित्र S2C) । इसदे अलावा, आटोफेजी कन्नै सरबंधत प्रोटीन दे मूल्यांकन च कोई खास बदलाव नेईं दिक्खेआ गेआ, जेह्ड़ा इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ते इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कन्नै विवो च दिक्खे गेदे आटोफेगोसोम दे दिक्खने आह्ले प्रेरण कन्नै मेल खंदा ऐ (चित्र S3) लेकन पीएनएस च प्रगतिशील आक्सफोस विकार दे कन्नै-कन्नै स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकॉन्ड्रिया च बदलाव होंदा ऐ । 5 ते 8 हफ्ते दी उम्र च Mfn2cKO पीएन दे कोशिका शरीर ते डेंड्राइटिक बूह्टे च माइटोकॉन्ड्रिया समूह दिक्खे जाई सकदे न , ते अंदरूनी झिल्ली दी संरचना च गंभीर बदलाव आया ऐ (चित्र S4, A ते B) इनें अल्ट्रास्ट्रक्चरल बदलावें ते mtDNA च मती कमी दे अनुरूप, टेट्रामिथाइलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (TMRM) कन्नै तीव्र सेरेब्रल सेरेब्रल स्लाइसें दे विश्लेषण कन्नै पता चलेआ जे Mfn2cKO पीएनएस च माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली दी क्षमता च काफी कमी आई ऐ (चित्र S4C)।
(ए) ऑक्सफोस परिसर दे अभिव्यक्ति स्तर दा समें कोर्स विश्लेषण। सिर्फ 8 हफ्ते च P<0.05 दे प्रोटीन (दो-तरफा एनोवा) पर विचार करो। बिंदीदार रेखा: सीटीआरएल दी तुलना च कोई समायोजन नेईं। (B) बाएं: एंटी-एमटीसीओ1 एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) कन्नै लेबल कीते गेदे सेरेब्रल खंड दा इक उदाहरण। पुर्किन्जे कोशिका शरीरें दा कब्जा करने आह्ला इलाका पीले रंग कन्नै ढके दा ऐ। दाएं: एमटीसीओ1 दे स्तर दी मात्रा निर्धारण (विचरण दा इक तरफा विश्लेषण; n = 7 थमां 20 कोशिकाएं दा विश्लेषण त्रै चूहें थमां)। (सी) छंटाई पीएन च mtDNA प्रतिलिपि संख्या दा qPCR विश्लेषण (विचरण दा इक तरफा विश्लेषण; n = 3 थमां 7 चूहे)। (D) बाएं: एंटी-डीएनए एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) कन्नै लेबल कीते गेदे सेरेब्रल स्लाइस दा इक उदाहरण। पुर्किन्जे कोशिका शरीरें दा कब्जा करने आह्ला इलाका पीले रंग कन्नै ढके दा ऐ। दाएं: mtDNA घावें दी मात्रा निर्धारण (विचरण दा इक तरफा विश्लेषण; n = त्रै चूहें थमां 5 थमां 9 कोशिकाएं)। (ई) पूरे कोशिका पैच क्लैंप रिकार्डिंग च माइटोवाईएफपी + पुर्किन्जे कोशिकाएं (तीर) गी दस्सने आह् ले इक तीव्र सेरेब्रल खंड दा इक उदाहरण। (च) चतुर्थ वक्र दी मात्रा निर्धारण। (जी) सीटीआरएल ते एमएफएन2सीकेओ पुर्किन्जे कोशिकाएं च डिपोलराइजिंग करंट इंजेक्शन दी प्रतिनिधि रिकार्डिंग। टॉप ट्रेस: ​​पैह्ली पल्स जिसने एपी गी ट्रिगर कीता। निचले ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति। (एच) पोस्टसिनैप्टिक स्वतःस्फूर्त इनपुट (एसपीएसपी) दी मात्रा निर्धारण। प्रतिनिधि रिकार्डिंग ट्रेस ते इसदा ज़ूम अनुपात (I) च दस्सेआ गेआ ऐ। विचरण दे इक तरफा विश्लेषण ने त्रै चूहें थमां n = 5 थमां 20 कोशिकाएं दा विश्लेषण कीता। डेटा औसत±SEM दे रूप च व्यक्त कीता जंदा ऐ; *पी <0.05 ऐ; ** पी <0.01 ऐ; ***पी <0.001 ऐ। (ज) छिद्रित पैच क्लैंप मोड दा उपयोग करदे होई रिकार्ड कीते गेदे स्वतःस्फूर्त एपी दे प्रतिनिधि निशान। शीर्ष ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति। निचले ट्रेस: ​​इक इकल एपी दा ज़ूम। (के) (जे) दे अनुसार औसत ते अधिकतम एपी आवृत्ति दी मात्रा निर्धारत करो। मान-व्हिटनी परीक्षण; n = 5 कोशिकाएं दा विश्लेषण चार चूहों थमां कीता गेआ। डेटा औसत±SEM दे रूप च व्यक्त कीता जंदा ऐ; महत्वै आह्ला नेईं।
8 हफ्ते दे Mfn2cKO PN च स्पष्ट OXPHOS नुकसान दा पता चलेआ ऐ, जेह्ड़ा इस गल्लै गी दस्सा करदा ऐ जे न्यूरॉन्स दा शारीरिक कम्म बड़ा गै असामान्य ऐ । इसलेई, असें तीव्र सेरेब्रल स्लाइसें च पूरे कोशिका पैच क्लैंप रिकार्डिंग करियै 4 थमां 5 हफ्तें ते 7 थमां 8 हफ्तें च OXPHOS दी कमी आह्ले न्यूरॉन्स दी निष्क्रिय विद्युत विशेषताएं दा विश्लेषण कीता (चित्र 2 ई)। अप्रत्याशित रूप च, Mfn2cKO न्यूरॉन्स दी औसत आराम झिल्ली क्षमता ते इनपुट प्रतिरोध नियंत्रण दे समान हा, हालांकि कोशिकाएं दे बश्कार सूक्ष्म अंतर हा (तालिका 1) । इसी गै 4 थमां 5 हफ्ते दी उम्र च करंट-वोल्टेज रिश्ते (IV वक्र) च कोई खास बदलाव नेईं दिक्खेआ गेआ (चित्र 2F) । लेकन 7 थमां 8 हफ्ते दी उम्र दे कोई बी Mfn2cKO न्यूरॉन्स IV रेजीम (हाइपरपोलराइजेशन स्टेप) थमां बची नेईं सकेआ, जेह्ड़ा इस गल्लै गी दस्सा करदा ऐ जे इस देरी दौर च हाइपरपोलराइजेशन दी संभावना आस्तै साफ संवेदनशीलता ऐ । इसदे बरोबर, Mfn2cKO न्यूरॉन्स च, डिपोलराइजिंग करंट जेह् ड़े दोहराए जाने आह् ले एक्शन पोटेंशियल (एपी) डिस्चार्ज पैदा करदे न, गी अच्छी तरह कन्नै सहन कीता जंदा ऐ, जेह् ड़ा इस गल्लै गी दर्शांदा ऐ जे उंदे समग्र डिस्चार्ज पैटर्न 8 हफ्ते दे नियंत्रण न्यूरॉन्स थमां मता बक्ख नेईं न ( तालिका 1 ते चित्र 2 जी ) इसी गै, स्वतःस्फूर्त पोस्टसिनैप्टिक करंट (sPSCs) दी आवृत्ति ते आयाम नियंत्रण समूह दे कन्नै तुलनीय ही, ते घटनाएं दी आवृत्ति 4 हफ्ते थमां 5 हफ्ते थमां 7 हफ्ते थमां 8 हफ्ते तगर बधी गेई जिस च इसी जनेही बद्धोबद्ध होआ (चित्र 2, एच ते आई) पीएनएस च सिनैप्टिक परिपक्वता दी अवधि (25)। छिद्रित पीएनएस पैच दे बाद बी इसी तरह दे नतीजे हासल होए। एह् विन्यास सेलुलर एटीपी दे दोषें दे संभावित मुआवजे गी रोकदा ऐ, जि’यां पूरे कोशिका पैच क्लैंप रिकार्डिंग च होई सकदा ऐ। खास करियै, Mfn2cKO न्यूरॉन्स दी आराम झिल्ली दी क्षमता ते अनायास फायरिंग आवृत्ति पर कोई असर नेईं पेआ (चित्र 2, जे ते के)। संक्षेप च, एह् नतीजे इस गल्लै गी दस्सनदे न जे स्पष्ट आक्सीजन विकार आह्ले पीएन उच्च आवृत्ति डिस्चार्ज पैटर्न कन्नै खरी चाल्ली निबड़ सकदे न, जेह् ड़ा इस गल्लै गी दस्सा करदा ऐ जे इक मुआवजा तंत्र ऐ जेह् ड़ा उ’नेंगी लगभग सामान्य इलेक्ट्रोफिजिओलॉजिकल प्रतिक्रियाएं गी बनाए रखने दी अनुमति दिंदा ऐ
आंकड़े औसत ± एसईएम (विचरण दा इक तरफा विश्लेषण, होल्म-सिडक दा बहु-तुलना परीक्षण; * पी <0.05) दे रूप च व्यक्त कीता गेआ ऐ। इकाई नंबर गी कोष्ठक कन्नै दर्शाया गेआ ऐ।
अस इस गल्लै दी जांच करने लेई रवाना होए जे प्रोटीओमिक्स डाटासेट (चित्र 1 जी) च कुसै बी श्रेणी च ऐसे रस्ते शामल न जेह् ड़े गंभीर OXPHOS दी कमी दा मुकाबला करी सकदे न, जिस कन्नै एह् समझाया जंदा ऐ जे प्रभावित पीएन लगभग सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी गी कीऽ बनाए रखी सकदा ऐ (चित्र 2, ई थमां के)। . प्रोटीओमिक्स विश्लेषण ने दस्सेआ जे शाखाबद्ध श्रृंखला अमीनो एसिड (बीसीएए) दे कैटाबोलिज्म च शामल एन्जाइम काफी हद तकर अप-रेगुलेट होंदे न (चित्र 3 ए ते चित्रा S5A), ते अंतिम उत्पाद एसिटाइल-कोए (कोए) जां सक्सिनिल कोए धमनीकाठिन्य एसिड (टीसीए) चक्र च ट्राइकार्बोक्जिलेटें दा पूरक होई सकदा ऐ। असें गी पता चलेआ जे बीसीएए ट्रांसएमिनेज़ 1 (बीसीएटी1) ते बीसीएटी2 दोनों दी सामग्री च वृद्धि होंदी ऐ। उन्नै α-कीटोग्लूटारेट ( 26 ) थमां ग्लूटामेट पैदा करियै बीसीएए कैटाबोलिज्म दे पैह् ले कदम गी उत्प्रेरक बनाया। शाखाबद्ध श्रृंखला कीटो एसिड डिहाइड्रोजनेज (बीसीकेडी) परिसर बनाने आह् ली सब्भै उप-इकाइयें गी अपरेगुलेट कीता जंदा ऐ (संकुल नतीजे च बीसीएए कार्बन कंकाल दे बाद दे ते अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्जिलेशन गी उत्प्रेरक बनांदा ऐ) (चित्र 3 ए ते चित्रा S5A)। लेकन छंटाई कीते गेदे पीएन च बीसीएए च अपने आपै च कोई स्पष्ट बदलाव नेईं दिक्खेआ गेआ, जेह्ड़ा इनें जरूरी अमीनो एसिड दे कोशिकाएं च बढ़ौतरी जां टीसीए चक्र दे पूरक आस्तै होर स्रोतें (ग्लूकोज जां लैक्टिक एसिड) दे इस्तेमाल दे कारण होई सकदा ऐ (चित्र S5B) OXPHOS दी कमी आह्ले पीएन च 8 हफ्ते दी उम्र च ग्लूटामाइन अपघटन ते ट्रांसएमिनेशन गतिविधियें च बी वृद्धि दिक्खी गेई ऐ , जेह्ड़ी माइटोकॉन्ड्रिया एन्जाइम ग्लूटामाइनेज (GLS) ते ग्लूटामाइन पाइरुवेट ट्रांसएमिनेज़ 2 (GPT2) दे अप-रेगुलेशन कन्नै दर्शाया जाई सकदा ऐ (चित्र 3, ए ते सी) ध्यान देने आह् ला ऐ जे जीएलएस दा अप-रेगुलेशन स्प्लिस आइसोफॉर्म ग्लूटामिनेज सी (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL दा बदलाव लगभग 4.5 गुना, P = 0.05) तगर सीमित ऐ, ते कैंसर दे ऊतकें च इसदा विशिष्ट अप-रेगुलेशन माइटोकॉन्ड्रिया जैव ऊर्जा दा समर्थन करी सकदा ऐ। (27) दा।
(ए) हीट मैप 8 हफ्ते च निर्दिश्ट रस्ते आस्तै प्रोटीन दे स्तर च गुना बदलाव गी दस्सदा ऐ । (B) एंटी-पीसीएक्स एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) कन्नै लेबल कीते गेदे सेरेब्रल स्लाइस दा उदाहरण। पीला तीर पुर्किन्जे कोशिका शरीर गी इशारा करदा ऐ। (C) एथेरोस्क्लेरोसिस (बहु टी-टेस्ट, * एफडीआर <5%; n = 3-5 चूहे) आस्तै इक महत्वपूर्ण उम्मीदवार दे रूप च चिह्नित समें कोर्स प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। (D) उप्पर: [1-13C] पाइरुवेट ट्रेसर च निहित लेबल कार्बन च प्रवेश दे बक्ख-बक्ख तरीकें गी दस्सने आह् ला योजनाबद्ध आरेख (यानी पीडीएच जां ट्रांस-आर्टेरियल मार्ग दे राहें)। थल्लै: वायलिन चार्ट च [1-13C] पाइरुवेट (जोड़ीदार टी-परीक्षण; ** P <0.01) कन्नै तीव्र सेरेब्रल स्लाइसें गी लेबल करने दे बाद एस्पार्टिक एसिड, साइट्रिक एसिड ते मैलिक एसिड च बदले गेदे इकल-लेबल कार्बन (M1) दा प्रतिशत दस्सदा ऐ। (ई) संकेत कीते गेदे रस्ते दा व्यापक समें इतिहास विश्लेषण। सिर्फ 8 हफ्ते च P<0.05 आह्ले प्रोटीन उप्पर गै विचार करो . डैश लाइन: कोई समायोजन मूल्य (विचरण दा दो-तरफा विश्लेषण; * पी <0.05; *** पी <0.001)। डेटा औसत±SEM दे रूप च व्यक्त कीता जंदा ऐ।
साढ़े विश्लेषण च बीसीएए कैटाबोलिज्म प्रमुख अप-रेगुलेशन मार्गें च शामल होई गेआ ऐ। एह् तथ्य इस गल्लै गी मजबूती कन्नै सुझाऽ दिंदा ऐ जे टीसीए चक्र च दाखल होने आह् ली वेंटिलेशन दी मात्रा च बदलाव आह् ले पीएन च आक्सीजन दी कमी आह् ले पीएन च बदली सकदा ऐ। एह् न्यूरॉन मेटाबोलिक रिवाइरिंग दे इक बड्डे रूप दा प्रतिनिधित्व करी सकदा ऐ , जेह्ड़ा गंभीर आक्सफोस विकार दे रखरखाव दे दौरान न्यूरॉन शरीर विज्ञान ते जीवित रौह् ने पर सीधा असर पाई सकदा ऐ । इस परिकल्पना दे अनुरूप, असें गी पता चलेआ जे मुख्य एंटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एन्जाइम पीसीएक्स अप-रेगुलेटेड ऐ (Mfn2cKO/CTRL लगभग 1.5 गुना बदलदा ऐ; चित्रा 3 ए), जेह्ड़ा पाइरूवेट दे ऑक्सालोएसीटेट च बदलने गी उत्प्रेरक बनांदा ऐ (28), जेह्ड़ा मस्तिष्क दे ऊतक च मन्नेआ जंदा ऐ The expression in एस्ट्रोसाइट्स (29, 30) तगर सीमित ऐ। प्रोटीओमिक्स दे नतीजें दे अनुरूप, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने दस्सेआ जे पीसीएक्स अभिव्यक्ति च विशेश रूप कन्नै ते काफी बद्धोबद्ध होआ ऐ , जदके पीसीएक्स प्रतिक्रियाशीलता मुख्य रूप कन्नै नियंत्रण दे बगल दे बर्गमैन ग्लिया कोशिकाएं तगर सीमित ही (चित्र 3 बी) पीसीएक्स दे दिक्खे गेदे अपरेग्यूलेशन दा कार्यात्मक परीक्षण करने आस्तै, असें [1-13C] पाइरुवेट ट्रेसर कन्नै तीव्र सेरेब्रल स्लाइसें दा इलाज कीता। जदूं पाइरूवेट गी पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज (पीडीएच) कन्नै आक्सीजन कीता गेआ तां इसदा आइसोटोप लेबल गायब होई गेआ , पर टीसीए चक्र दे बिचौलियें च शामल कीता जंदा ऐ जिसलै पाइरूवेट संवहनी प्रतिक्रियाएं कन्नै चयापचय होंदा ऐ (चित्र 3 डी)। साढ़े प्रोटीओमिक्स डेटा दे समर्थन च, असें Mfn2cKO स्लाइसें दे एस्पार्टिक एसिड च इस ट्रेसर थमां मार्करें दी बड़ी मती गिनतरी दिक्खी, जिसलै के साइट्रिक एसिड ते मैलिक एसिड च बी मध्यम रुझान हा, हालांकि एह् महत्वपूर्ण नेईं हा (चित्र 3 डी)।
माइटोपार्क चूहें दे डोपामाइन न्यूरॉन्स च माइटोकॉन्ड्रिया दे विकार दे कारण डोपामाइन न्यूरॉन्स च विशेश रूप कन्नै माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसक्रप्शन फैक्टर ए जीन (Tfam) (चित्र S6B) गी नष्ट करने आह्ले, पीसीएक्स अभिव्यक्ति गी बी काफी हद तकर अप-रेगुलेट कीता गेआ हा (31), जेह्ड़ा इस गल्लै गी दर्शांदा ऐ जे एसीटोन एसिड धमनीकाठिन्य न्यूरॉन दे विकार दे दौरान बीमारी दी घटना नियंत्रित होंदी ऐ शरीर च ऑक्सफोस। ध्यान देने आह् ला ऐ जे एह् दिक्खेआ गेआ ऐ जे अनोखे एन्जाइम (32-34) जेह् ड़े न्यूरॉन्स च अभिव्यक्त होंदे न जेह् ड़े धमनीकाठिन्य कन्नै जुड़े दे होई सकदे न , ओक्सफोस दी कमी आह् ले पीएन च काफी अप-रेगुलेट होंदे न , जि’यां प्रोपिओनाइल-कोए कार्बोक्जिलेज (पीसीसी-ए), मैलोनिल-कोए प्रोपिओनाइल-कोए गी सुक्सिनिल-कोए ते माइटोकॉन्ड्रिया मैलिक एन्जाइम 3 (ME3), जिसदी मुक्ख भूमिका मैलेट थमां पाइरूवेट गी बरामद करना ऐ (चित्र 3, ए ते सी) (33, 35)। इसदे अलावा, असें गी पीडीके 3 एन्जाइम च मती बढ़ौतरी दिक्खी गेई, जेह् ड़ा फास्फोरिलेशन करदा ऐ ते इस चाल्लीं पीडीएच गी निष्क्रिय करदा ऐ ( 36 ), जदके पीडीपी 1 एन्जाइम च कोई बदलाव नेईं दिक्खेआ गेआ जेह् ड़ा पीडीएच जां खुद पीडीएच एन्जाइम परिसर च सक्रिय करदा ऐ (चित्र 3 ए)। लगातार, Mern2cKO पीएनएस च, Ser293 (पीडीएच दी एन्जाइम गतिविधि गी रोकने आस्तै जानेआ जंदा ऐ) च पीडीएच परिसर दे पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज ई 1 घटक दे α1 उप-इकाई α (PDHE1α) उप-इकाई दा फास्फोरिलेशन बधाया गेआ (चित्र S6C) (चित्र S6C)। पाइरुवेट दी कोई संवहनी पहुंच नेईं होंदी ऐ ।
आखरी च, असें गी पता चलेआ जे सेरीन ते ग्लाइसिन जैव संश्लेषण दा सुपर मार्ग, सरबंधत माइटोकॉन्ड्रिया फोलेट (1C) चक्र ते प्रोलाइन जैव संश्लेषण (चित्र 1G ते चित्रा S5C) सारें गी सक्रियकरण प्रक्रिया दे दौरान, रिपोर्टें दे अनुसार, मता अप-रेगुलेट कीता जंदा ऐ। आसपास दे ऊतक माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी कन्नै सक्रिय होंदे न (5-7) । इनें प्रोटीओमिक्स डेटा दा समर्थन करने आह् ले कन्फोकल विश्लेषण ने दस्सेआ जे OXPHOS लापता होने आह् ले पीएन च 8 हफ्ते दे चूहें दे सेरेब्रल स्लाइसें गी माइटोकॉन्ड्रिया फोलेट चक्र दा इक प्रमुख एन्जाइम सेरीन हाइड्रोक्सीमिथाइलट्रांसफरेज़ 2 (SHMT2) दे अधीन कीता गेआ हा। महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (चित्र एस 5 डी)। 13 सीयू-ग्लूकोज-इन्क्यूबेटेड तीव्र सेरेब्रल स्लाइसें च, मेटाबोलिक ट्रेसिंग प्रयोगें ने सेरीन ते प्रोलाइन बायोसिंथेसिस दे अप-रेगुलेशन दी होर पुष्टि कीती, जिस कन्नै एह् संकेत होंदा ऐ जे सेरीन ते प्रोलाइन च कार्बन आइसोफॉर्म दा प्रवाह बधी गेआ ऐ (चित्र S5E)। चूंकि GLS ते GPT2 द्वारा बढ़ावा दित्ती गेई प्रतिक्रियाएं ग्लूटामाइन थमां ग्लूटामेट दे संश्लेषण ते ग्लूटामेट ते α-कीटोग्लूटारेट दे बश्कार ट्रांसएमिनेशन आस्तै जिम्मेदार न , इस करियै उंदा अपरेग्यूलेशन इस गल्लै गी दर्शांदा ऐ जे OXPHOS दी कमी आह्ले न्यूरॉन्स च ग्लूटामेट दी मंग बधी जंदी ऐ , इसदा मकसद प्रोलाइन दे बधाए गेदे जैव संश्लेषण गी बनाए रखना होई सकदा ऐ (चित्र S5C) इनें बदलावें दे विपरीत, पीएन-विशिष्ट Mfn2cKO चूहें थमां सेरेब्रल एस्ट्रोसाइट्स दे प्रोटीओमिक विश्लेषण ने दस्सेआ जे एह् रस्ते (सभनें एंटीपेरोक्साइडेज समेत) अभिव्यक्ति च मता बदलाव नेईं आया, इस चाल्लीं एह् सिद्ध कीता गेआ ऐ जे एह् चयापचय पुनर्निर्देशन क्षीण पीएन आस्तै चयनात्मक ऐ (चित्र S6, डी थमां जी)।
संक्षेप च, इनें विश्लेशने कन्नै पीएनएस च विशिश्ट चयापचय मार्गें दे अस्थायी सक्रियकरण दे काफी बक्ख-बक्ख पैटर्न दिक्खे गे। हालांकि असामान्य न्यूरॉन माइटोकॉन्ड्रिया दे कम्मै च शुरुआती धमनीकाठिन्य ते 1C रिमोडलिंग (चित्र 3E ते चित्रा S5C) दा कारण बनी सकदा ऐ, ते इत्थूं तगर जे I ते IV परिसरें दी अभिव्यक्ति च पूर्वानुमानित बदलाव बी होई सकदा ऐ, पर सेरीन डी नोवो संश्लेषण च बदलाव सिर्फ एह् सिर्फ देर दे चरणें च गै साफ होई गेआ ऐ ऑक्सफॉस विकार (चित्र 3 ई ते चित्रा एस 5 सी)। एह् निष्कर्ष इक क्रमिक प्रक्रिया गी परिभाशित करदे न जेह्दे च तनाव-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया (1C चक्र) ते साइटोप्लाज्मिक (सेरीन बायोसिंथेसिस) टीसीए चक्र च एथेरोस्क्लेरोसिस च वृद्धि कन्नै समन्वयात्मक रूप कन्नै प्रतिक्रिया दिंदे न ते न्यूरॉन चयापचय गी नमें सिरेआ आकार दिंदे न
8 हफ्ते दे ओक्सफोस दी कमी आह्ले पीएन उच्च आवृत्ति उत्तेजना गतिविधि गी बनाए रखी सकदे न ते माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी दी भरपाई करने आस्तै मता चयापचय पुनर्गठन करी सकदे न । एह् खोज इक दिलचस्प संभावना पैदा करदी ऐ जे इस पल च बी एह् कोशिकाएं गी न्यूरोडीजनरेशन गी देरी जां रोकने आस्तै चिकित्सकीय हस्तक्षेप बी हासल होई सकदा ऐ । चिरें। अस इस संभावना दा हल दो स्वतंत्र हस्तक्षेपें दे राएं कीता। पैह् ली विधि च, असें इक Cre-निर्भर एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (AAV) वेक्टर डिजाइन कीता तां जे MFN2 गी विवो च OXPHOS-कमी आह् ले पीएन च चुनिंदा रूप कन्नै व्यक्त कीता जाई सकै (चित्र S7A)। MFN2 ते फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) गी एन्कोडिंग करने आह् ले एएवी गी विट्रो च प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियें च सत्यापन कीता गेआ, जिसदे कारण MFN2 गी Cre-निर्भर तरीके कन्नै व्यक्त कीता गेआ ते माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान गी बचाया, जिस कन्नै Mfn2cKO न्यूरॉन्स च न्यूरोम्यूटेशन गी रोकेआ गेआ (चित्र S7, B, D ते E)। अगले, असें 8 हफ्ते दे Mfn2-AAV गी Mfn2cKO ते नियंत्रण चूहें दे सेरेब्रल कॉर्टेक्स च स्टीरियोटैक्टिक रूप कन्नै डिलीवर करने आस्तै विवो प्रयोग कीते, ते 12 हफ्ते दे चूहें दा विश्लेषण कीता (चित्र 4 ए)। इलाज कीते गेदे Mfn2cKO चूहों दी मौत होई गेई (चित्र 1, ए ते बी) (16)। विवो च वायरस ट्रांसडक्शन दे नतीजे च किश सेरेब्रल सर्कल च पीएन दी चयनात्मक अभिव्यक्ति होई (चित्र S7, G ते H)। सिर्फ mCherry (Ctrl-AAV) गी एक्सप्रेस करने आह् ले नियंत्रण एएवी दे इंजेक्शन कन्नै Mfn2cKO जानवरें च न्यूरोडीजनरेशन दी डिग्री पर कोई खास असर नेईं पेआ। इसदे बरोबर, Mfn2-AAV कन्नै ट्रांसड्यूस कीते गेदे Mfn2cKOs दे विश्लेषण च पीएन कोशिका परत दा इक महत्वपूर्ण सुरक्षा प्रभाव दिक्खेआ गेआ (चित्र 4, बी ते सी)। खास करियै, न्यूरॉन घनत्व नियंत्रण जानवरें थमां लगभग अभेद्य प्रतीत होंदा ऐ (चित्र 4, बी ते सी, ते चित्रा S7, एच ते आई) । MFN1 दी अभिव्यक्ति पर MFN2 दी अभिव्यक्ति न्यूरॉन दी मौत गी बचाने च उतनी गै प्रभावी ऐ (चित्र 4C ते चित्र S7, C ते F), जेह्ड़ा इस गल्लै गी दर्शांदा ऐ जे एक्टोपिक MFN1 दी अभिव्यक्ति MFN2 दी कमी गी प्रभावी ढंगै कन्नै पूरक करी सकदी ऐ इकल पीएन स्तर पर होर विश्लेषण ने दस्सेआ जे Mfn2-AAV ने बड्डे पैमाने पर माइटोकॉन्ड्रिया दी अल्ट्रास्ट्रक्चर गी बचाया, mtDNA दे स्तर गी सामान्य कीता, ते एंटी-एंजियोजेनेसिस मार्कर पीसीएक्स दी उच्च अभिव्यक्ति गी उल्टा कीता (चित्र 4, सी थमां ई) आराम दी स्थिति च बचाए गेदे Mfn2cKO चूहें दे दृष्टिगत निरीक्षण कन्नै पता चलेआ जे उंदी मुद्रा ते मोटर लक्षण (S1 थमां S3 दी गतिविधि) च सुधार होआ ऐ । निष्कर्ष च, एह् प्रयोग दस्सदे न जे OXPHOS च गंभीर कमी आह्ले पीएन च MFN2 दा देरी कन्नै पुनर्प्रवेश करना mtDNA दे खपत गी उल्टा करने ते एथेरोस्क्लेरोसिस गी प्रेरित करने आस्तै काफी ऐ , जिस कन्नै विवो च एक्सोन डिजनरेशन ते न्यूरॉन दी मौत गी रोकने च मदद मिलदी ऐ
(ए) संकेत च चयापचय मार्ग सक्रिय होने पर एमएफएन2 गी एन्कोडिंग करने आह् ले एएवी इंजेक्ट करने आस्तै प्रयोगात्मक शेड्यूल गी दस्सने आह् ली योजना। (B) 8 हफ्तें च Mfn2cKO चूहें कन्नै ट्रांसड्यूस कीते गेदे ते एंटी-कैलबिंडिन एंटीबॉडी कन्नै लेबल कीते गेदे 12 हफ्ते दे सेरेब्रल सेक्शनें दी प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफ। दाएं: अक्षतंतु रेशे दा स्केलिंग। एक्सन ज़ूम दा पैमाना 450 ते 75 माइक्रोन ऐ। (सी) बाएं: एएवी ट्रांसडक्शन लूप (एएवी +) च पुर्किन्जे कोशिका घनत्व दी मात्रा निर्धारण (विचरण दा इक तरफा विश्लेषण; n = 3 चूहे)। दाएं: 12 हफ्ते च ट्रांसड्यूस्ड पीएन च mtDNA फोकस विश्लेषण (अनपेयर टी-टेस्ट; n = त्रै चूहों थमां 6 कोशिकाएं)। * पी <0.05 ऐ; ** पी <0.01 ऐ। (D) संकेत कीते गेदे वायरल वैक्टरें कन्नै ट्रांसड्यूस कीते गेदे Mfn2cKO सेरेब्रल खंडें दे पीएन दे प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। गुलाबी मास्क डेंड्राइट्स दे कब्जे आले इलाके गी दर्शांदा ऐ, ते पीले बिंदीदार वर्ग दाएं पास्से दित्ते गेदे ज़ूम गी दर्शांदा ऐ; n नाभिक दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ। पैमाने पर बार, 1 माइक्रोन। (ई) 12 हफ्ते च ट्रांसड्यूस कीते गेदे पीएन च पीसीएक्स दाग दा इक उदाहरण दस्सदा ऐ। पैमाने पर बार, 20μm। ओई, ओवरएक्सप्रेशन; एफसी, गुना बदलाव।
आखरी च, असें उनें पीएन च पेरोक्साइड-प्रेरित कोशिकाएं दे जीवित रौह् ने दे महत्व दी जांच कीती जेह् ड़े आक्सफोस दी गड़बड़ी दा अनुभव करदे न। अस माउस PCx mRNA (AAV-shPCx) गी खास तौर उप्पर निशाना बनांदे होई एएवी-shRNA (छोटे हेयरपिन आरएनए) गी एन्कोडिंग करने आह् ले mCherry पैदा कीता, ते वायरस जां इसदे स्क्रैम्बल नियंत्रण (AAV-scr) गी Mfn2cKO चूहें दे सेरेब्रल च इंजेक्ट कीता। इंजेक्शन उमर दे चौथे हफ्ते च (चित्र 5 ए) कीता गेआ हा तां जे उस अवधि दौरान प्रभावी पीसीएक्स नॉक डाउन हासल कीता जाई सकै जिसलै पीसीएक्स एक्सप्रेशन च वृद्धि होंदी ऐ (चित्र 3 सी) ते पीएन सेल परत अजें बी बरकरार ही (चित्र 1 ए) ध्यान देने आह् ला ऐ जे पीसीएक्स (चित्र S8A) गी खटखटाने कन्नै पीएन मौत च काफी तेजी औंदी ऐ, जेह्ड़ी संक्रमण दी इकमात्र प्रतिबंधित रिंग ऐ (चित्र 5, बी ते सी) । पीसीएक्स अप-रेगुलेशन कन्नै प्रेरित चयापचय प्रभावें दे तंत्र गी समझने आस्तै, असें पीसीएक्स नॉक डाउन दे बाद पीएन दी रेडॉक्स स्थिति दा अध्ययन कीता ते एएवी-मध्यस्थ ऑप्टिकल बायोसेंसर Grx1-roGFP2 गी इक साथ व्यक्त कीता गेआ (चित्र S8, बी थमां डी) ग्लूटाथियोन दा मूल्यांकन करने आस्तै पेप्टाइड रेडॉक्स क्षमता च सापेक्ष बदलाव (38)। फिर, अस 7 हफ्ते दे Mfn2cKO जां नियंत्रण लिटरमेट दे तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें च दो-फोटॉन फ्लोरोसेंस जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) कीता तां जे FLIM दी स्थिति दी सत्यापन दे बाद साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थिति च संभावित बदलाव दा पता लाया जाई सकै (चित्र S8, ई थमां जी)। विश्लेषण ने पीसीएक्स अभिव्यक्ति दी कमी आह् ले इक Mfn2cKO पीएन दी ऑक्सीडेशन स्थिति च काफी वृद्धि दिक्खी, जेह् ड़ी नियंत्रण न्यूरॉन्स जां सिर्फ स्क्रैम्बल shRNA गी एक्सप्रेस करने आह् ले Mfn2cKO पीएन थमां बक्ख ऐ (चित्र 5, डी ते ई)। जदूं पीसीएक्स एक्सप्रेशन गी डाउन-रेगुलेट कीता गेआ तां Mfn2cKO पीएन दे प्रतिशत च उच्च ऑक्सीडाइज्ड स्थिति दस्सने च त्रै गुना थमां मती बढ़ौतरी होई (चित्र 5E), जिस कन्नै एह् दस्सेआ गेआ ऐ जे पीसीएक्स अप-रेगुलेशन ने डिजनरेट न्यूरॉन्स दी रेडॉक्स क्षमता गी बनाए रखेआ।
(ए) संकेत च चयापचय मार्ग सक्रिय होने पर shPCx गी एन्कोडिंग करने आह् ले एएवी इंजेक्ट करने आस्तै प्रयोगात्मक शेड्यूल गी दस्सने आह् ली योजना। (B) 4 हफ्ते च एंटी-कैल्सीन्यूरिन एंटीबॉडी कन्नै ट्रांसड्यूस ते लेबल कीते गेदे Mfn2cKO चूहें च 8 हफ्ते दे सेरेब्रल सेक्शनें दी प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफ। पैमाने पर बार, 450μm। (सी) एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप च पुर्किन्जे कोशिका घनत्व दी मात्रा निर्धारण (विचरण दा इक तरफा विश्लेषण; n = 3 थमां 4 चूहे)। डेटा औसत±SEM दे रूप च व्यक्त कीता जंदा ऐ; ***पी <0.001 ऐ। (D) प्रतिनिधि एफएलआईएम तस्वीर निर्दिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थितियें च ग्लूटाथियोन रेडॉक्स सेंसर Grx1-roGFP2 गी एक्सप्रेस करने आह् ले 7 हफ्ते दे पीएन दी औसत जीवन अवधि गी दस्सदी ऐ। एलयूटी (लुक-अप तालिका) अनुपात: जीवित रौह् ने दा समां अंतराल (पिकोसेकंड च)। पैमाने पर बार, 25μm। (ई) हिस्टोग्राम (D) (हर शर्त दे तहत दो चूहें च n = 158 थमां 368 कोशिकाएं) थमां Grx1-roGFP2 जीवनकाल दे मूल्यें दा वितरण दस्सदा ऐ। हर हिस्टोग्राम दे उप्पर पाई चार्ट : काफी लम्मे (लाल, ऑक्सीडाइज्ड) जां घट्ट (नीले, घट्ट) जीवन अवधि मूल्यें आह् ले कोशिकाएं दी संख्या दस्सदा ऐ, जेह् ड़ी CTRL-AAV-scr च औसत जीवन अवधि मूल्य दे 1 एसडी थमां मती ऐ (F) प्रस्तावित मॉडल न्यूरॉन पीसीएक्स दे अपरेग्यूलेशन दा सुरक्षात्मक प्रभाव दस्सदा ऐ।
कुल मिलाइयै, इत्थै दित्ते गेदे आंकड़े दस्सदे न जे MFN2 दी पुनर्अभिव्यक्ति गंभीर OXPHOS दी कमी, गंभीर mtDNA दी कमी, ते बेह्तर असामान्य ista-जैसी आकृति विज्ञान कन्नै उन्नत पीएन गी पूरी चाल्लीं बचाई सकदी ऐ, जिस कन्नै उन्नत बमारियें च बी लगातार प्रगति प्रदान कीती जाई सकदी ऐ न्यूरोडीजनरेशन कोशिकाएं दी मौत थमां पैह्ले दे चरण दा उलटने आह्ला सबूत दिंदा ऐ । चयापचय दी लचीलापन दी इस डिग्री गी न्यूरॉन्स दी एथेरोस्क्लेरोसिस (टीसीए चक्र दा इक रिवायरिंग) पैदा करने दी क्षमता कन्नै होर जोर दित्ता जंदा ऐ, जेह्ड़ा आक्सफोस दी कमी आह्ले पीएन च पीसीएक्स एक्सप्रेसन गी रोकदा ऐ ते कोशिकाएं दी मौत गी बधांदा ऐ, जिस कन्नै सुरक्षात्मक भूमिका निभांदा ऐ (चित्र 5F)
इस अध्ययन च असें इस गल्लै दा सबूत दित्ता जे आक्सफोस दे विकारें च पीएनएस दा प्रतिक्रिया चयापचय प्रोग्रामें कन्नै सक्रिय विभेदक सक्रियकरण मार्ग दे माध्यम कन्नै टीसीए चक्र धमनीकाठिन्य च धीरे-धीरे अभिसरण करना ऐ अस मते सारे पूरक तरीकें कन्नै प्रोटीओमिक विश्लेषण दी पुष्टि कीती ते पता चलेआ जे जदूं गंभीर माइटोकॉन्ड्रिया विकार कन्नै चुनौती दित्ती जंदी ऐ तां न्यूरॉन्स च चयापचय लोच दा इक पैह् ले थमां गै अज्ञात रूप होंदा ऐ। साढ़े आश्चर्य दी गल्ल एह् ऐ जे पूरी रिवाइरिंग प्रक्रिया जरूरी नेईं ऐ जे ओह् टर्मिनल मेटाबोलिक स्थिति गी चिन्नत करदी ऐ जेह्ड़ी न्यूरोडीजनरेशन दे कन्नै-कन्नै धीरे-धीरे ते अपरिवर्तनीय रूप कन्नै होंदी ऐ , पर साढ़े आंकड़े दा सुझाऽ दिंदा ऐ जे एह् कोशिका दी मौत थमां पैह्ले दे चरण च बी इक रखरखाव न्यूरॉन दा गठन करी सकदा ऐ कार्यात्मक मुआवजा तंत्र एह् खोज इस गल्लै गी दस्सा करदी ऐ जे न्यूरॉन्स च शरीर च मेटाबॉलिक प्लास्टिक दी काफी डिग्री होंदी ऐ । एह् तथ्य साबित करदा ऐ जे एमएफएन2 दे बाद च पुनर्प्रवर्तन कन्नै मुक्ख चयापचय मार्करें दी अभिव्यक्ति गी उल्टा करी सकदा ऐ ते पीएन दी क्षय गी रोक सकदा ऐ । उल्टा एह् धमनीकाठिन्य गी रोकदा ऐ ते नसें गी तेज करदा ऐ । ट्रांससेक्सुअल।
साढ़े शोध च इक सारें शा मता आकर्षक निष्कर्ष एह् ऐ जे आक्सफोस दी कमी आह् ले पीएन टीसीए चक्र च चयापचय गी संशोधित करी सकदे न जेह् ड़े एन्जाइमें गी अप-रेगुलेट करदे न जेह् ड़े विशेश रूप कन्नै धमनीकाठिन्य गी उत्तेजित करदे न । चयापचय पुनर्व्यवस्था कैंसर कोशिकाएं दी इक आम विशेषता ऐ , जिंदे चा किश घट्ट करने आह्ले समकक्ष पैदा करने आस्तै टीसीए चक्र दे बिचौलियें गी पूरक करने आस्तै ग्लूटामाइन उप्पर निर्भर करदे न , जेह्ड़े श्वसन श्रृंखला गी चलांदे न ते लिपिड ते न्यूक्लियोटाइड जैव संश्लेषण पूर्ववर्तीएं दे उत्पादन गी बनाए रखदे न ( 39 , 40 ) हाल दे इक अध्ययन च दस्सेआ गेआ ऐ जे आक्सफोस दी गड़बड़ी दा अनुभव करने आह्ले परिधीय ऊतकें च ग्लूटामाइन/ग्लूटामेट चयापचय दा पुनर्गठन बी इक प्रमुख विशेषता ऐ ( 5 , 41 ), जित्थें टीसीए चक्र च ग्लूटामाइन दे प्रवेश दी दिशा ऑक्सफोस दी चोट दी गंभीरता दे कारण ( 41 ) उप्पर निर्भर करदी ऐ ). लेकन शरीर च न्यूरॉन मेटाबोलिक प्लास्टिक दी कुसै बी समानता ते रोग दे संदर्भ च इसदी संभावित प्रासंगिकता दे बारे च साफ सबूत दी कमी ऐ । हाल दे इक इन विट्रो अध्ययन च, प्राथमिक कोर्टिकल न्यूरॉन्स गी न्यूरोट्रांसमिशन आस्तै ग्लूटामेट पूल गी मोबिलाइज करने च दिक्खेआ गेआ ऐ, जिस कन्नै चयापचय तनाव दी स्थिति च ऑक्सीडेटिव मेटाबॉलिज्म ते एथेरोस्क्लेरोसिस गी बढ़ावा दित्ता गेआ ऐ ( 42 ) ध्यान देने आह् ला ऐ जे टीसीए चक्र एन्जाइम सुसिनेट डिहाइड्रोजनेज दे औषधीय निरोध दे अंतर्गत, पाइरूवेट कार्बोक्जिलेशन संस्कारित सेरेब्रल दाने न्यूरॉन्स च ऑक्सालोएसीटेट दे संश्लेषण गी बनाए रखने आस्तै मन्नेआ जंदा ऐ ( 34 ) लेकन मस्तिष्क दे ऊतकें कन्नै इनें तंत्रें दी शारीरिक प्रासंगिकता (जित्थें एथेरोस्क्लेरोसिस गी मुख्य रूप कन्नै एस्ट्रोसाइट्स तकर सीमित मन्नेआ जंदा ऐ ) दा अजें बी महत्वपूर्ण शारीरिक महत्व ऐ ( 43 ) इस मामले च, साढ़े आंकड़े दस्सदे न जे शरीर च आक्सफोस कन्नै क्षतिग्रस्त पीएन गी बीसीएए डिग्रेडेशन ते पाइरूवेट कार्बोक्जिलेशन च बदलेआ जाई सकदा ऐ, जेह्ड़े टीसीए पूल इंटरमीडिएट दे पूरक आहार दे दो मुक्ख स्रोत न। हालांकि न्यूरॉन ऊर्जा चयापचय च बीसीएए कैटाबोलिज्म दा कथित योगदान प्रस्तावित कीता गेआ ऐ, पर न्यूरोट्रांसमिशन आस्तै ग्लूटामेट ते जीएबीए दी भूमिका दे अलावा ( 44 ), विवो च इनें तंत्रें दा अजें बी कोई सबूत नेईं ऐ इसलेई एह् अनुमान लाना बड़ा सौखा ऐ जे बेकाबू पीएन एथेरोस्क्लेरोसिस गी बधाइयै आत्मसात प्रक्रिया कन्नै प्रेरित टीसीए इंटरमीडिएट दे खपत दा स्वतः भरपाई करी सकदे न । खास करियै, एस्पार्टिक एसिड दी बद्धोबद्ध मंग गी बनाए रखने आस्तै पीसीएक्स दे अपरेग्यूलेशन दी लोड़ हो सकदी ऐ, जेह्ड़ी माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी कन्नै प्रजनन कोशिकाएं च दिक्खी गेई ऐ ( 45 ) । हालांकि, साढ़े मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण ने Mfn2cKO पीएनएस च एस्पार्टिक एसिड दे स्थिर-स्थिति स्तर च कोई महत्वपूर्ण बदलाव नेईं दिक्खेआ (चित्र S6A), जेह्ड़ा संभवत: प्रजनन कोशिकाएं ते पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स दे बश्कार एस्पार्टिक एसिड दे बक्ख-बक्ख चयापचय उपयोग गी दर्शांदा ऐ हालांकि विवो च बेकाबू न्यूरॉन्स च पीसीएक्स अपरेग्यूलेशन दे सटीक तंत्र दी विशेषता बाकी ऐ, पर असें एह् सिद्ध कीता जे एह् समें कोला पैह्ले प्रतिक्रिया न्यूरॉन्स दी रेडॉक्स स्थिति गी बनाए रखने च महत्वपूर्ण भूमिका निभांदी ऐ, जेह्ड़ी सेरिबेलर स्लाइसें पर एफएलआईएम प्रयोगें च प्रदर्शित कीती गेई ही। खास करियै पीएनएस गी पीसीएक्स गी अप-रेगुलेट करने थमां रोकने कन्नै मती आक्सीजन स्थिति पैदा होई सकदी ऐ ते कोशिकाएं दी मौत च तेजी आई सकदी ऐ । बीसीएए दे अपघटन दी सक्रियता ते पाइरूवेट दा कार्बोक्जिलेशन माइटोकॉन्ड्रिया दी विकार दे परिधीय ऊतकें दी विशेषता बनाने दे तरीके नेईं न ( 7 ) । इसलेई एह् आक्सीजन दी कमी आह्ले न्यूरॉन्स दी प्राथमिकता आह्ली विशेषता दिक्खने गी मिलदी ऐ , भलेआं एह् इकमात्र विशेषता नेईं होऐ , जेह्ड़ी न्यूरोडीजनरेशन आस्तै मती जरूरी ऐ । .
सेरेब्रल रोग इक विषम किस्म दी न्यूरोडिजनरेटिव बीमारी ऐ जेह्ड़ी आमतौर पर अटैक्सिया दे रूप च प्रकट होंदी ऐ ते अक्सर पीएन गी नुकसान पजांदी ऐ ( 46 ) । एह् न्यूरॉन आबादी माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी आस्तै खासतौर उप्पर कमजोर ऐ की जे चूहें च उंदी चयनात्मक क्षय रोग दे मते सारे मोटर लक्षणें गी पुनर्जीवित करने आस्तै काफी ऐ जेह्ड़े मनुक्खी स्पाइनल सेरेबेलर अटैक्सिया दी विशेषता ऐ ( 16 , 47 , 48 ) रिपोर्टें दे अनुसार, इक उत्परिवर्तित जीन कन्नै इक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मनुक्खी स्पाइनल सेरेबेलर अटैक्सिया कन्नै जुड़े दा ऐ ते माइटोकॉन्ड्रिया दी विकार ( 49 , 50 ) ऐ , जेह्ड़ी पीएनपीएच च आक्सफोस दी कमी दे नतीजें दा अध्ययन करने दे महत्व उप्पर जोर दिंदा ऐ इसलेई इस अनोखी न्यूरॉन आबादी गी प्रभावी ढंगै कन्नै अलग करने ते अध्ययन करने लेई खास तौर उप्पर उपयुक्त ऐ । लेकन एह् दिक्खदे होई जे पीएन दबाव दे प्रति बड्डे संवेदनशील न ते पूरे सेरेब्रल कोशिका आबादी दा घट्ट अनुपात ऐ , मते सारे ओमिक्स आह्ले अध्ययनें आस्तै , पूरे कोशिकाएं दे रूप च उ’नेंगी चुनिंदा रूप कन्नै बक्ख करना अजें बी इक चुनौतीपूर्ण पहलू ऐ हालांकि, होर कोशिकाएं दे किस्में (खासकर वयस्क ऊतकें) दे संदूषण दी बिल्कुल कमी हासल करना लगभग असंभव ऐ, पर अस डाउनस्ट्रीम प्रोटीओमिक्स विश्लेषण आस्तै पर्याप्त संख्या च व्यवहार्य न्यूरॉन्स हासल करने आस्तै FACS कन्नै इक प्रभावी विच्छेदन कदम गी जोड़ेआ, ते पूरे सेरेब्रल दे मौजूदा डेटा सेट दी तुलना च काफी उच्च प्रोटीन कवरेज (लगभग 3000 प्रोटीन) ऐ (51)। पूरे कोशिकाएं दी व्यवहार्यता गी बचाइयै, जेह् ड़ी विधि अस इत्थै उपलब्ध करोआने आं, ओह् न सिर्फ माइटोकॉन्ड्रिया च चयापचय मार्गें च बदलाव दी जांच करने दी अनुमति दिंदा ऐ, बल्के अपने साइटोप्लाज्मिक समकक्षें च बदलाव दी जांच करने दी बी अनुमति दिंदा ऐ, जेह्ड़ा कोशिकाएं दे किस्में आस्तै विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली लेबल समृद्धि दे इस्तेमाल दा पूरक ऐ जटिल ऊतकें च माइटोकॉन्ड्रिया दी संख्या आस्तै नमीं विधि (52, 53) जिस विधि दा अस वर्णन करदे आं ओह् न सिर्फ पुर्किन्जे कोशिकाएं दे अध्ययन कन्नै सरबंधत ऐ , बल्के बीमार दिमाग च चयापचय दे बदलाव गी संबोधित करने आस्तै किसे बी किस्म दे कोशिका च बी आसानी कन्नै लागू कीता जाई सकदा ऐ , जिंदे च माइटोकॉन्ड्रिया दी गड़बड़ी दे होर माडल बी शामल न
आखरी च, असें इस चयापचय पुनर्व्यवस्था प्रक्रिया दे दौरान इक चिकित्सकीय खिड़की दी पन्छान कीती ऐ जेह्ड़ी कोशिकाएं दे तनाव दे मुक्ख संकेतें गी पूरी चाल्लीं उल्टा करी सकदी ऐ ते न्यूरॉन दी क्षय गी रोक सकदी ऐ । इसलेई इत्थै वर्णत रिवाइरिंग दे कार्यात्मक प्रभावें गी समझने कन्नै माइटोकॉन्ड्रिया दी विकार दे दौरान न्यूरॉन दी व्यवहार्यता गी बनाए रखने आस्तै संभावित इलाजें दे बारे च बुनियादी जानकारी दित्ती जाई सकदी ऐ । मस्तिष्क कोशिकाएं दे होर किस्में च ऊर्जा चयापचय च बदलाव गी विच्छेदन करने दे मकसद कन्नै भविष्य च शोध दी लोड़ ऐ तां जे इस सिद्धांत दी होर न्यूरोलॉजिकल बमारियें च लागू होने दी पूरी चाल्लीं पता लग्गी सकै ।
माइटोपार्क चूहों दा वर्णन पैह्लें गै कीता गेआ ऐ ( 31 ) । loxP फ्लैंकिंग Mfn2 जीन कन्नै C57BL/6N चूहें दा वर्णन पैह्लें गै कीता गेआ ऐ ( 18 ) ते L7-Cre चूहें कन्नै संकर कीता गेआ ऐ ( 23 ) । इसदे बाद नतीजे च डबल हेटरोजाइगस संतान गी होमोजाइगस Mfn2loxP/Mfn2loxP चूहें कन्नै पार करियै Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) आस्तै पुर्किन्जे-विशिष्ट जीन नॉकआउट पैदा कीता गेआ। संभोग दे इक उप-समूह च, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP एलील (stop-mtYFP) गी अतिरिक्त क्रॉस ( 20 ) दे माध्यम कन्नै पेश कीता गेआ। सारे जानवरें दी प्रक्रिया यूरोपीय, राश्ट्री ते संस्थागत दिशा-निर्देशें दे अनुसार कीती गेई ही ते जर्मनी दे उत्तरी राइन-वेस्टफेलिया दे उमवेल्ट ते वर्ब्राउचरशुट्ज दे लैंडसैमटफुरनाचर आसेआ मंजूर कीता गेआ हा। पशुएं दे कम्मै च यूरोपीय फेडरेशन आफ लैबोरेटरी एनिमल साइंसेज एसोसिएशन दे मार्गदर्शन दा बी पालन कीता जंदा ऐ ।
गर्भवती महिला दे गर्भाशय ग्रीवा दे डिस्लोकेशन गी बेहोश करने दे बाद माउस दे भ्रूण गी अलग कीता जंदा ऐ (E13) । प्रांतस्था गी 10 मिमी हेपेस दे पूरक हैनक्स दे संतुलित नमक घोल (HBSS) च विच्छेदन कीता गेआ ते दुलबेको दे संशोधित ईगल दे माध्यम पर पपीते (20 U/ml) ते सिस्टीन (1μg/ml) युक्त कीता गेआ। ऊतक गी डीएमईएम च इन्क्यूब करो) ते एन्जाइमी पाचन कन्नै इसगी विच्छेदन करो। एमएल) 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट तगर, ते फिर 10% भ्रूण गोहे दे सीरम कन्नै पूरक डीएमईएम च यांत्रिक रूप कन्नै मिलदा ऐ । कोशिकाएं गी इमेजिंग विश्लेषण आस्तै 2×106 प्रति 6 सेमी कल्चर डिश जां 0.5×105 कोशिकाएं/सेमी2 घनत्व कन्नै पॉलीलाइसिन कन्नै लेपित कांच दे कवरस्लिप पर बीऽ दित्ता गेआ हा। 4 घैंटें दे बाद, माध्यम गी न्यूरोबेसल सीरम-मुक्त माध्यम कन्नै बदलेआ गेआ जेह्दे च 1% बी 27 पूरक ते 0.5 मिमी ग्लूटामैक्स हा। इसदे बाद न्यूरॉन्स गी पूरे प्रयोग च 37 डिग्री सेल्सियस ते 5% सीओ 2 पर रक्खेआ गेआ हा, ते हफ्ते च इक बारी खिलाया गेआ हा। विट्रो च पुनर्संयोजन गी प्रेरित करने आस्तै, विट्रो च दुए दिन न्यूरॉन्स दे इलाज आस्तै निम्नलिखित AAV9 वायरस वेक्टर दे 3μl (24-वेल कल्चर डिश) जां 0.5μl (24-वेल प्लेट) दा इस्तेमाल कीता गेआ: AAV9.CMV.PI.eGFP WPRE.bGH (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105530-AAV9) ते AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105545-AAV9)।
माउस Mfn1 ते Mfn2 पूरक डीएनए (क्रमशः Addgene प्लाज्मिड #23212 ते #23213 थमां हासल) गी सी-टर्मिनस पर V5 अनुक्रम (GKPIPNPLLGLDST) कन्नै चिह्नित कीता जंदा ऐ, ते T2A अनुक्रम दे माध्यम कन्नै फ्रेम च mCherry कन्नै फ्यूज कीता जंदा ऐ। Grx1-roGFP2 हाइडलबर्ग टीपी डिक डीएफकेजेड (ड्यूचेस क्रेब्सफोर्शंग्सज़ेंट्रम) दा इक उपहार ऐ। परंपरागत क्लोनिंग तरीकें दा इस्तेमाल करियै tdTomato कैसेट गी बदलियै, कैसेट गी pAAV-CAG-FLEX-tdTomato बैकबोन (Addgene संदर्भ संख्या 28306) च सबक्लोन कीता गेआ तां जे pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ते... pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 वैक्टर। नियंत्रण वेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry पैदा करने लेई इसी चाल्ली दी रणनीति दा इस्तेमाल कीता गेआ। एएवी-shPCx निर्माण पैदा करने आस्तै, इक प्लाज्मिड एएवी वेक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) दी लोड़ ऐ, जिस च माउस PCx (5′CTTTCGCTCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG) गी लक्ष्य करने आह् ले shRNA गी एन्कोड करने आह् ला डीएनए अनुक्रम होंदा ऐ 3′) U6 प्रमोटर दे नियंत्रण च, mCherry दा इस्तेमाल सीएमवी प्रमोटर दे नियंत्रण च कीता जंदा ऐ। सहायक एएवी वैक्टरें दा उत्पादन निर्माता दे निर्देशें (सेल बायोलैब्स) दे अनुसार कीता गेआ। संक्षेप च, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) गी क्षणिक रूप कन्नै 293AAV कोशिकाएं दा संक्रमण-T2A-MFN1-V5), mCherry लेई जाने आह् ला हस्तांतरण प्लाज्मिड दा इस्तेमाल करो (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) जां Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीन, ते कन्नै गै AAV1 कैप्सिड प्रोटीन ते सहायक प्रोटीन पैकेजिंग प्लाज्मिड प्लाज्मिड कोडिंग, कैल्शियम फास्फेट विधि दा उपयोग करदे होई। कच्चे वायरस सुपरनेटेंट गी शुष्क बर्फ/इथानॉल स्नान च फ्रीज-थॉ चक्र ते फास्फेट बफर खारा (पीबीएस) च लाइसेड कोशिकाएं कन्नै हासल कीता गेआ। एएवी वेक्टर गी असतत आयोडिक्सनॉल ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (32,000 आरपीएम ते 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घैंटे) कन्नै शुद्ध कीता गेआ ते एमिकॉन अल्ट्रा-15 सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर दा उपयोग करियै गाढ़ा कीता गेआ। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX दा जीनोम टीटर पैह्ले वर्णत (54) दे अनुसार हा, जिसगी रियल-टाइम मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा मापा गेआ हा। -MFN1-V5 (1.9 × 1013 जीसी / एमएल) ते एएवी1-सीएजी-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9 × 1012 जीसी / एमएल)।
प्राथमिक न्यूरॉन्स गी बर्फ-ठंडे 1x पीबीएस च खुरचने, गोली मारने, ते फिर 0.5% ट्राइटन एक्स-100 / 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोलेट/पीबीएस लाइसिस बफर च होमोजीनाइज कीता गेआ जिस च फास्फेटेज ते प्रोटीज इंहिबिटर (Roche) हा। प्रोटीन दी मात्रा निर्धारण बाइसिन्कोनिनिक एसिड परीक्षण (थर्मो फिशर साइंटिफिक) दा उपयोग करियै कीता गेआ। इसदे बाद प्रोटीन गी एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस कन्नै बक्ख कीता गेआ, ते उसदे बाद इक पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड झिल्ली (जीई हेल्थकेयर) पर ब्लॉट कीता गेआ। गैर-विशिष्ट थाह् रें गी ब्लॉक करो ते टीबीएसटी च 5% दुद्ध च 5% दुद्ध च प्राथमिक एंटीबॉडी (विस्तार लेई तालिका S1 दिक्खो), धोने दे कदम ते टीबीएसटी इनक्यूबेट च सेकेंडरी एंटीबॉडी कन्नै इनक्यूब करो। प्राथमिक एंटीबॉडी कन्नै रातीं +4 डिग्री सेल्सियस पर इन्क्यूबेट करो। धोने दे बाद सेकेंडरी एंटीबॉडी गी कमरे दे तापमान पर 2 घैंटें तगर लाओ । इसदे बाद, उस्सै ब्लॉट गी एंटी-β-एक्टिन एंटीबॉडी कन्नै इनक्यूब करियै, उस्सै लोडिंग दी पुष्टि कीती गेई। केमिलुमिनेसेंस च बदलियै ते केमिलुमिनेसेंस (जीई हेल्थकेयर) गी बधाइयै पता लाना।
शीशे दे कवरस्लिप पर पैह् ले बीऽ दे न्यूरॉन्स गी 4% पैराफार्माल्डीहाइड (पीएफए)/पीबीएस कन्नै निर्धारत समें बिंदु पर कमरे दे तापमान पर 10 मिनट तगर स्थिर कीता गेआ हा। कवरस्लिपें गी पैह् ले थमां गै 0.1% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस कन्नै कमरे दे तापमान पर 5 मिनट तगर, ते फिर ब्लॉकिंग बफर [3% गोहे दे सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)/पीबीएस च पारित कीता जंदा ऐ। दूए दिन, कवरस्लिप गी ब्लॉकिंग बफर कन्नै धोया गेआ ते कमरे दे तापमान पर 2 घैंटें तगर उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित सेकेंडरी एंटीबॉडी कन्नै इन्क्यूब कीता गेआ; आखरी च, नमूनें गी 4′,6-डायमिडिनो-2 -फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) कन्नै पीबीएस च पूरी चाल्लीं धोया गेआ हा ते इसदे बाद एक्वा-पॉली/माउंट कन्नै माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्थिर कीता गेआ।
चूहें (नर ते मादा) गी केटामाइन (130 मिलिग्राम/किलोग्राम) ते ज़ाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) दे इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन कन्नै बेहोश कीता गेआ ते चमड़ी दे हेठ कार्प्रोफेन दर्द निवारक (5 मिलीग्राम/किलोग्राम) कन्नै प्रशासित कीता गेआ , ते गर्म पैड कन्नै लैस स्टीरियोटैक्टिक उपकरण (Kopf) च रक्खेआ गेआ। खोपड़ी गी उजागर करो ते मिस हड्डी दे अनुरूप सेरेब्रल कोर्टेक्स दे हिस्से गी पतला करने आस्तै दंत चिकित्सा ड्रिल दा इस्तेमाल करो (लैम्ब्डा थमां: पूंछ 1.8, लैटरल 1, लोब्यूल IV ते V दे अनुरूप) । खोपड़ी च इक छोटा छेद बनाने आस्तै इक घुमावदार सिरिंज सुई दा इस्तेमाल करो तां जे हेठले संवहनी गी बाधित नेईं कीता जा । फिर पतले खिच्चे गेदे कांच दे केशिका गी धीरे-धीरे माइक्रो-होल (ड्यूरा मेटर दे उदर पास्से -1.3 थमां -1 तगर) च पाया जंदा ऐ, ते 200 थमां 300 एनएल एएवी गी मैन्युअल सिरिंज (नरिशिगे) कन्नै माइक्रो-इंजेक्टर (नरिशिगे) च केईं बारी 10 थमां 20 मिनट दी अवधि च घट्ट दबाव च इंजेक्ट कीता जंदा ऐ इंफ्यूजन दे बाद केशिका गी 10 मिंट होर रक्खो तां जे वायरस पूरी चाल्लीं फैल सकै । केशिकाएं गी वापस कड्ढने दे बाद चमड़ी गी सावधानी कन्नै सिवनी कीती जंदी ऐ तां जे घाव दी सूजन घट्ट होई सकै ते जानवर गी ठीक होने दी अनुमति दित्ती जा । जानवरें गी ऑपरेशन दे बाद केईं दिनें तकर दर्द निवारक दवाएं (कैस्पोफेन) कन्नै इलाज कीता गेआ हा, जिस दौरान उंदी शारीरिक स्थिति दी सावधानी कन्नै निगरानी कीती गेई ही ते उसदे बाद उ’नेंगी दस्से गेदे समें च मृत्यदंड दित्ता गेआ हा। सब्भै प्रक्रियाएं गी यूरोपीय, राष्ट्रीय ते संस्थागत दिशा-निर्देशें दे मताबक कीता गेआ हा ते जर्मनी दे उत्तरी राइन-वेस्टफेलिया दे उमवेल्ट ते वर्ब्राउचरशुट्ज दे लैंडसैमटफुरनाचर आसेआ मंजूर कीता गेआ हा।
जानवरें गी केटामाइन (100 मिलिग्राम/किलोग्राम) ते ज़ाइलाज़ीन (10 मिलिग्राम/किलोग्राम) कन्नै बेहोश कीता गेआ हा, ते दिल गी पैह्लें 0.1 एम पीबीएस कन्नै, ते फिर पीबीएस च 4% पीएफए ​​कन्नै परफ्यूज कीता गेआ हा। ऊतक गी विच्छेदन करियै 4% पीएफए/पीबीएस च रातीं दे समें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर कीता गेआ। पीबीएस च स्थिर मस्तिष्क थमां सैजिटल सेक्शन (50 माइक्रोन मोटाई) तैयार करने आस्तै इक कंपन चाकू (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) दा इस्तेमाल कीता गेआ। जदूं तकर एह् नेईं दस्सेआ गेआ हा, मुक्त-तैह्त खंडें दा धुंधलापन कमरे दे तापमान ते हलचल पर उप्पर दित्ते गेदे तरीके कन्नै (13) कीता गेआ। संक्षेप च, पैह् ले, हासल स्लाइसें गी 0.5% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस कन्नै कमरे दे तापमान पर 15 मिनट तगर पारगम्य कीता गेआ; किश एपिटोप (Pcx ते Shmt2) आस्तै, इस कदम दे बजाय 80 डिग्री सेल्सियस (पीएच 9) पर ट्रिस-ईडीटीए बफर च स्लाइसें गी 25 मिनट तगर गरम करो। अगले, खंडें गी हलचल कन्नै 4 डिग्री सेल्सियस पर रातीं दे समें ब्लॉकिंग बफर (3% बीएसए/पीबीएस) च प्राथमिक एंटीबॉडी (देखो तालिका S1) कन्नै इन्क्यूब कीता गेआ। अगले दिन, खंडें गी ब्लॉकिंग बफर कन्नै धोया गेआ ते कमरे दे तापमान पर 2 घैंटें तगर उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित सेकेंडरी एंटीबॉडी कन्नै इन्क्यूब कीता गेआ; आखरी च, खंडें गी पीबीएस च पूरी चाल्लीं धोया गेआ, डीएपीआई कन्नै काउंटर-स्टेन कीता गेआ, ते फिर एक्वापॉलीमाउंट कन्नै माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ठीक कीता गेआ।
नमूने दी छवि बनाने लेई लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी8-एक्स जां टीसीएस डिजिटल लाइट शीट, लीका माइक्रोसिस्टम) दा इस्तेमाल कीता गेआ जेह् ड़ा सफेद प्रकाश लेजर ते 405 डायोड पराबैंगनी लेजर कन्नै लैस हा। फ्लोरोफोर गी उत्तेजित करियै ते हाइब्रिड डिटेक्टर (HyDs) कन्नै सिग्नल इकट्ठा करियै, LAS-X सॉफ्टवेयर दा इस्तेमाल क्रमबद्ध मोड च Nyquist नमूनें दे अनुरूप ढेर छवियें गी इकट्ठा करने लेई कीता गेआ: गैर-मात्रा पैनल आस्तै, एह् उच्च गतिशील संकेत ऐ (उदाहरण दे तौर पर, दैहिक कोशिकाएं ते डेंड्राइट्स च) mtYFP) BrightR मोड च पीएन दी संख्या दा पता लाने आस्तै HyD दा इस्तेमाल करो)। बैकग्राउंड गी घट्ट करने लेई 0.3 थमां 6 एनएस दी गेटिंग लागू कीती जंदी ऐ।
छंटाई कीती गेदी कोशिकाएं दी रियल-टाइम इमेजिंग। 1% B27 पूरक ते 0.5 mM GlutaMax युक्त न्यूरोबेसल-ए माध्यम च छंटाई करने दे बाद, कोशिकाएं गी फौरन पाली-एल-लाइसिन-लेपित कांच दी स्लाइड्स (μ-Slide8 Well, Ibidi, कैटलॉग नंबर 80826) पर बीऽ दित्ता गेआ हा, ते फिर इसगी 37°C ते 5% CO2 पर 1 घैंटे तगर रक्खेआ गेआ हा तां जे कोशिकाएं गी बसने दी अनुमति दित्ती जा। रियल-टाइम इमेजिंग गी सफेद लेजर, HyD, 63×[1.4 संख्यात्मक एपर्चर (NA)] तेल उद्देश्य लेंस ते इक हीटिंग स्टेज कन्नै लैस लीका SP8 लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप पर कीता गेआ।
माउस गी जल्दी कार्बन डाइऑक्साइड कन्नै बेहोश करी दित्ता गेआ ते सिर कट्टी दित्ता गेआ, दिमाग गी जल्दी खोपड़ी थमां कड्ढी लैता गेआ, ते 200μm मोटी (13C लेबलिंग प्रयोग आस्तै) जां 275μm मोटी (दो फोटॉन प्रयोगें आस्तै) धनुषी खंड च कटौती कीती गेई जेह् ड़ी निम्नलिखित सामग्री कन्नै भरी गेई ही आइसक्रीम (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) निम्नलिखित पदार्थें कन्नै भरोचे दा ऐ: 125 मिमी बर्फ-ठंडा, कार्बन-संतृप्त (95% O2 ते 5% CO2) कम Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फास्फेट बफर, 25 mM NaHCO3, 25 mM ग्लूकोज, 0.5 mM CaCl2 ते... 3.5 मिमी MgCl2 (310 थमां 330 मिलीमोल दा आसमाटिक दबाव)। प्राप्त मस्तिष्क स्लाइसें गी उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फास्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 ते 2.0 mM MgCl2) युक्त प्री-इन्क्यूबेशन कक्ष च स्थानांतरित करो। मध्यम) पीएच 7.4 ते 310 थमां 320 मिलीमोल)।
इमेजिंग प्रक्रिया दे दौरान स्लाइसें गी समर्पित इमेजिंग रूम च लेई गेआ हा, ते प्रयोग गी 32° थमां 33 डिग्री सेल्सियस दे लगातार तापमान पर लगातार एसीएसएफ परफ्यूजन दे हेठ कीता गेआ। स्लाइस इमेजिंग आस्तै इक मल्टीफोटन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी8 एमपी-ओपीओ, लीका माइक्रोसिस्टम्स) जेह् ड़ा लीका 25x ऑब्जेक्टिव लेंस (एनए 0.95, पानी) कन्नै लैस हा, टीआई: नीलम लेजर (गिरगिट विजन II, कोहेरेंट) दा इस्तेमाल कीता गेआ। एफएलआईएम मॉड्यूल (पिकोहार्प300, पिकोक्वांट)।
Grx1-roGFP2 दा FLIM। पीएन दी साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थिति च बदलाव गी सैजिटल ब्रेन स्लाइस च दो-फोटॉन एफएलआईएम कन्नै मापा गेआ हा, जित्थें Grx1-roGFP2 बायोसेंसर ने पीएन गी निशाना बनाया हा। पीएन परत च, अधिग्रहण क्षेत्र गी स्लाइस सतह थमां लगभग 50 थमां 80 माइक्रोन थमां हेठ चुनेआ जंदा ऐ तां जे एह् सुनिश्चित कीता जाई सकै जे इक व्यवहार्य पीएन (अर्थात, डेंड्राइट्स दे कन्नै-कन्नै मनके संरचना जां न्यूरॉन आकृतिक बदलाव दी कमी) ते डबल पॉजिटिव roGFP2 सेंसर ते एएवी एन्कोडिंग shRNA PCx जां इसदे नियंत्रण अनुक्रम (हर इक सह-एक्सप्रेसिंग mCherry) होऐ। 2x डिजिटल ज़ूम [उत्तेजना तरंगदैर्ध्य: 890 एनएम; 512 एनएम 512 पिक्सेल] ऐ। पता लाना: आंतरिक HyD, फ्लोरोसेन आइसोथियोसाइनेट (FITC) फ़िल्टर समूह] ते 2 थमां 3 मिंटें दे अंदर औसतन छवि दा उपयोग इस गल्लै गी सुनिश्चित करने लेई कीता जंदा ऐ जे वक्र फिटिंग लेई पर्याप्त फोटॉन इकट्ठा कीता जा (कुल 1000 फोटॉन)। Grx1-roGFP2 जांच दी संवेदनशीलता ते FLIM शर्तें दा सत्यापन roGFP2 दे जीवन काल मूल्य दी निगरानी करियै कीता गेआ हा, जिसलै परफ्यूजन ACSF च बहिर्जात 10 mM H2O2 जोड़ेआ जंदा ऐ (ऑक्सीडेशन गी मती बनाने आस्तै, जिसदे फलस्वरूप जीवन काल च वृद्धि होंदी ऐ), ते फिर 2 mM डाइथियोथ्राइटोल (कम करने दी डिग्री गी घट्ट करने आस्तै, जिसदे फलस्वरूप कमी होंदी ऐ)। जीवन काल च) (चित्र एस 8, डी ते जी)। हासल नतीजें दा विश्लेषण करने आस्तै FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेयर दा उपयोग करो, मापे गेदे आईआरएफ (इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन) च पूरी छवि दे इकल घातीय क्षय वक्र गी फिट करो, ते χ2 लगभग 1 ऐ, इक गै पीएन दे जीवनकाल दी गणना करने आस्तै, तंत्रिका शरीर दे आसपास दा मास्क मैन्युअल रूप कन्नै खींचया गेआ हा, ते हर मास्क च औसत जीवनकाल दा उपयोग मात्रा निर्धारण आस्तै कीता गेआ हा।
माइटोकॉन्ड्रिया संभावित विश्लेषण। तीव्र खंड गी 30 मिनट तगर परफ्यूम कीते गेदे एसीएसएफ च सीधे तौर पर जोड़े गेदे 100 एनएम टीएमआरएम कन्नै इनक्यूब करने दे बाद पीएन दे माइटोकॉन्ड्रिया संभावित बदलाव गी दो-फोटोन माइक्रोस्कोप कन्नै मापा गेआ। टीएमआरएम इमेजिंग गी 920 एनएम पर जांच गी उत्तेजित करियै ते संकेत इकट्ठा करने आस्तै आंतरिक HyD (टेट्रामिथाइलरोडामाइन आइसोथियोसाइनेट: 585/40 एनएम) दा उपयोग करियै कीता गेआ; इक गै उत्तेजना तरंगदैह् क दा उपयोग करियै पर छवि mtYFP आस्तै इक बक्ख आंतरिक HyD (FITC :525/50) दा उपयोग करियै। इकल कोशिका स्तर पर माइटोकॉन्ड्रिया दी क्षमता दा मूल्यांकन करने लेई ImageJ दे इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन दा उपयोग करो। संक्षेप च, प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = मिन (mtYFP, TMRM) दा उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र दी पन्छान करने लेई कीता जंदा ऐ जेह् ड़ा संबंधित चैनल दी इकल-स्टैक कॉनफोकल छवि च पुर्किन्जे सोमाली च टीएमआरएम सिग्नल गी दस्सदा ऐ। फिर नतीजे च मास्क च पिक्सेल क्षेत्र दी मात्रा निर्धारत कीती जंदी ऐ, ते फिर mtYFP चैनल दी अनुरूप थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टैक छवि पर सामान्य कीता जंदा ऐ तां जे माइटोकॉन्ड्रिया दी क्षमता दस्सने आह् ला माइटोकॉन्ड्रिया अंश हासल कीता जाई सकै।
छवि गी ह्यूजेंस प्रो (साइंटिफिक वॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ्टवेयर कन्नै डिकॉन्वोल्यूट कीता गेआ। टाइलें दी स्कैन कीती गेदी तस्वीरें लेई, इक टाइल दा मोंटाज लास-एक्स सॉफ्टवेयर आसेआ दित्ते गेदे स्वचालित सिलाई एल्गोरिथम दा उपयोग करियै कीता जंदा ऐ। छवि कैलिब्रेशन दे बाद, छवि गी होर प्रोसेस करने ते चमक ते कंट्रास्ट गी इक समान रूप कन्नै समायोजित करने लेई ImageJ ते Adobe Photoshop दा इस्तेमाल करो। ग्राफिक तैयारी लेई एडोब इलस्ट्रेटर दा इस्तेमाल करो।
mtDNA फोकस विश्लेषण। एमटीडीएनए दे घावें दी संख्या गी कन्फोकल माइक्रोस्कोप कन्नै डीएनए दे खिलाफ एंटीबॉडी कन्नै लेबल कीते गेदे सेरेब्रल सेक्शनें पर मात्रा निर्धारत कीती गेई। हर इक लक्ष्य क्षेत्र गी कोशिका शरीर ते हर कोशिका दे नाभिक आस्तै बनाया गेआ हा, ते मल्टी मेजर प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेयर) दा उपयोग करियै संबंधित क्षेत्र दी गणना कीती गेई ही। कोशिका शरीर दे क्षेत्र थमां नाभिकीय क्षेत्र गी घट्ट करियै कोशिका द्रव्य क्षेत्र हासल करो । आखरी च, थ्रेशोल्ड इमेज पर mtDNA गी दर्शाने आह् ले साइटोप्लाज्मिक डीएनए बिंदुएं गी स्वचालित रूप कन्नै मात्रा निर्धारत करने आस्तै एनालाइज़ पार्टिकल प्लग-इन (ImageJ सॉफ्टवेयर) दा इस्तेमाल कीता गेआ, ते हासल नतीजें गी सीटीआरएल चूहें दे पीएन औसत च सामान्य कीता गेआ। नतीजें गी हर कोशिका च न्यूक्लिओसाइड दी औसत संख्या दे रूप च दर्शाया जंदा ऐ ।
प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। इकल कोशिका स्तर पर पीएन च प्रोटीन अभिव्यक्ति दा मूल्यांकन करने लेई इमेज जे दे इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन दा उपयोग करो। संक्षेप च, सरबंधत चैनल दी इक-परत कन्फोकल छवि च, समीकरण: सिग्नल = मिन (mtYFP, एंटीबॉडी) दे माध्यम कन्नै, माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र जेह् ड़ा पुर्किना च इक खास एंटीबॉडी गी इम्यूनोरिएक्टिविटी दस्सदा ऐ, दी पन्छान कीती जंदी ऐ। फिर नतीजे च मास्क च पिक्सेल क्षेत्र दी मात्रा निर्धारत कीती जंदी ऐ, ते फिर प्रदर्शत प्रोटीन दा माइटोकॉन्ड्रिया अंश हासल करने आस्तै mtYFP चैनल दी अनुरूप थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टैक छवि पर सामान्य कीता जंदा ऐ।
पुर्किन्जे कोशिका घनत्व विश्लेषण। इमेजजे दे सेल काउंटर प्लग-इन दा इस्तेमाल पुर्किन्जे घनत्व दा मूल्यांकन करने आस्तै कीता गेआ हा, जिस च गिने गेदे कोशिकाएं आसेआ कब्जा कीती गेदी सेरेब्रल रिंग दी लंबाई कन्नै विभाजित कीता गेआ हा।
नमूने दी तैयारी ते संग्रहण। नियंत्रण समूह ते Mfn2cKO चूहें दे दिमाग गी 0.1 एम फास्फेट बफर (पीबी) च 2% पीएफए/2.5% ग्लूटारएलडीहाइड च फिक्स कीता गेआ, ते फिर कोरोनल खंडें गी सिलिएट्स (Leica Mikrosysteme GmbH, वियना, ऑस्ट्रिया) (मोटाई 50 थमां 60 माइक्रोन) दा उपयोग करियै तैयार कीता गेआ, फिर 1% ओस टेट्राऑक्साइड च पीबी बफर च फिक्स कीता गेआ ते... 1.5% पोटैशियम फेरोसाइनाइड गी कमरे दे तापमान पर 1 घैंटे तगर। खंडें गी आसुत पानी कन्नै त्रै बारी धोया गेआ, ते उसदे बाद 20 मिनट तगर 1% यूरेनिल एसीटेट युक्त 70% इथानॉल कन्नै दाग दित्ता गेआ। इसदे बाद खंडें गी ग्रेड कीते गेदे अल्कोहल च निर्जलीकरण कीता गेआ ते सिलिकॉन लेपित कांच दी स्लाइड्स दे बिच्च दुरकुपन एसीएम (अरलडाइट कास्टिंग रेजिन एम) इपोक्सी राल (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज, कैटलॉग नंबर 14040) च एम्बेड कीता गेआ, ते अंत च 60 डिग्री सेल्सियस पर 48 घैंटे तगर ओवन च पॉलिमराइज कीता गेआ। सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्र दा चयन कीता गेआ ते 50 एनएम अल्ट्राथिन खंडें गी लीका अल्ट्राकट (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) पर कट्टियै पॉलीस्टायरीन फिल्म कन्नै लेपित 2×1 मिमी तांबे दे स्लिट ग्रिड पर चुनेआ गेआ। खंडें गी H2O च 4% यूरेनाइल एसीटेट दे घोल कन्नै 10 मिनट तगर दाग दित्ता गेआ, H2O कन्नै केईं बारी धोया गेआ, फिर H2O च रेनॉल्ड्स सीसा साइट्रेट कन्नै 10 मिनट तगर धोया गेआ, ते फिर H2O कन्नै केईं बारी धोया गेआ। माइक्रोग्राफ गी टीवीआईपीएस (टीएट्ज वीडियो ते इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम) टेमकैम-एफ416 डिजिटल कैमरा (टीवीआईपीएस जीएमबीएच, गौटिंग, यूएसए) दा उपयोग करियै ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप फिलिप्स सीएम100 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) कन्नै लैता गेआ। जर्मनी)।
एएवी कन्नै संक्रमित चूहें आस्तै मस्तिष्क गी बक्ख कीता गेआ ते 1 मिमी मोटी सैजिटल सेक्शन च कट्टी दित्ता गेआ, ते एएवी संक्रमित रिंग (अर्थात mCherry एक्सप्रेसिंग) दी पन्छान करने आस्तै फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप दा इस्तेमाल करियै सेरेब्रल दी जांच कीती गेई। सिर्फ उ’नें प्रयोगें दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ जिंदे च एएवी इंजेक्शन दे नतीजे च घट्ट शा घट्ट दो लगातार सेरेब्रल रिंग च पुर्किन्जे कोशिका परत (यानी लगभग पूरी परत) दी बड्डी उच्च संप्रेषण दक्षता होंदी ऐ । एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप गी रातीं दे बाद फिक्सेशन (0.1 एम कोकोएट बफर च 4% पीएफए ​​ते 2.5% ग्लूटारएलडीहाइड) आस्तै माइक्रोडिसेक्ट कीता गेआ ते होर प्रोसेस कीता गेआ। ईपीओएन एम्बेडिंग आस्तै, स्थिर ऊतक गी 0.1 एम सोडियम कोकोएट बफर (एप्लिकेम) कन्नै धोया गेआ हा, ते 0.1 एम सोडियम कोकोएट बफर (एप्लिकेम) च 2% OsO4 (ओएस, साइंस सर्विसेज; काको) कन्नै 4 घैंटे इंक्यूब कीता गेआ हा, फिर 2 घैंटे तगर धोया गेआ हा। 0.1 एम कोकामाइड बफर कन्नै 3 बारी दोहराओ। इसदे बाद, ऊतक गी निर्जलीकरण करने आस्तै हर इक इथानॉल घोल गी 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तगर इन्क्यूबेशन करने आस्तै इथानॉल दी चढ़ने आह् ली श्रृंखला दा इस्तेमाल कीता गेआ। ऊतक गी प्रोपलीन आक्साइड च स्थानांतरित कीता गेआ ते 4 डिग्री सेल्सियस पर ईपीएन (सिग्मा-एल्ड्रिच) च रातीं-रात इन्क्यूब कीता गेआ। ऊतक गी ताजा ईपीओएन च कमरे दे तापमान पर 2 घैंटें तगर रक्खो, ते फिर इसगी 62 डिग्री सेल्सियस पर 72 घैंटे तगर एम्बेड करो। 70 एनएम अल्ट्राथिन खंडें गी कट्टने आस्तै अल्ट्रामाइक्रोटोम (Leica Microsystems, UC6) ते हीरे दे चाकू (Diatome, Biel, Switzerland) दा इस्तेमाल करो, ते 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तगर 1.5% यूरेनाइल एसीटेट कन्नै दाग करो, ते सीसा साइट्रेट घोल कन्नै 4 मिनट दाग करो। इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ कैमरा वनव्यू 4के 16-बिट (गटन) ते डिजिटलमाइक्रोग्राफ सॉफ्टवेयर (गटन) कन्नै लैस जेईएम-2100 प्लस ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (जेईओएल) दा उपयोग करदे होई लैते गे हे। विश्लेषण आस्तै, इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ गी 5000× जां 10,000× डिजिटल ज़ूम कन्नै हासल कीता गेआ।
माइटोकॉन्ड्रिया दा आकृति विज्ञान विश्लेषण। सारे विश्लेशने लेई, व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया दे समोच्च गी इमेजजे सॉफ्टवेयर दा उपयोग करियै डिजिटल छवियें च मैन्युअल रूप कन्नै रेखांकित कीता गेआ। बक्ख-बक्ख रूपात्मक पैरामीटर दा विश्लेषण कीता जंदा ऐ। माइटोकॉन्ड्रिया घनत्व हर कोशिका दे कुल माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र गी साइटोप्लाज्म क्षेत्र (साइटोप्लाज्म क्षेत्र = कोशिका क्षेत्र-कोशिका नाभिक क्षेत्र) × 100 कन्नै विभाजित करियै हासल प्रतिशत दे रूप च दर्शाया जंदा ऐ , माइटोकॉन्ड्रिया दी गोलाई दी गणना सूत्र [4π∙(क्षेत्र/परिधि 2) कन्नै कीती जंदी ऐ माइटोकॉन्ड्रिया दे इस्टा आकृति विज्ञान दा विश्लेषण कीता गेआ ते उंदे मुक्ख आकृतियें दे अनुसार दो श्रेणियें च (“ट्यूबुलर” ते “ब्लिस्टर”) बंडेआ गेआ।
ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संख्या ते घनत्व विश्लेषण। डिजिटल छवि च हर इक आटोफेगोसोम/लाइसोसोम दे समोच्च गी मैन्युअल रूप कन्नै रूपरेखा बनाने लेई इमेजजे सॉफ्टवेयर दा उपयोग करो। आटोफेगोसोम/लाइसोसोम क्षेत्र गी हर कोशिका दे कुल आटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचना क्षेत्र गी साइटोप्लाज्म क्षेत्र (साइटोप्लाज्म क्षेत्र=कोशिका क्षेत्र-नाभिक क्षेत्र)×100 कन्नै विभाजित करियै गणना कीते गेदे प्रतिशत दे रूप च दर्शाया जंदा ऐ । आटोफेगोसोम/लाइसोसोम दी घनत्व दी गणना कुल संख्या गी प्रति कोशिका आटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचनाएं दी संख्या (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र दे संदर्भ च) (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र = कोशिका क्षेत्र-नाभिक क्षेत्र) कन्नै विभाजित करियै कीती जंदी ऐ
तीव्र खंडन ते नमूने दी तैयारी आस्तै लेबलिंग। उनें प्रयोगें लेई जिंदे च ग्लूकोज लेबल दी लोड़ होंदी ऐ, तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें गी इक प्री-इन्क्यूबेशन चैंबर च स्थानांतरित करो, जिस च संतृप्त कार्बन (95% O2 ते 5% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फास्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM होंदा ऐ d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl 2 ते 2.0 mM MgCl 2, पीएच 7.4 ते 310 थमां 320 mOsm च समायोजित), जिस च ग्लूकोज 13 C 6- ग्लूकोज प्रतिस्थापन (Eurisotop, कैटलॉग नंबर CLM-1396) ऐ। ऐसे प्रयोगें लेई जिंदे च पाइरूवेट लेबल दी लोड़ होंदी ऐ, तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें गी उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फास्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 ते 2.0mM जोड़ो) च स्थानांतरित करो MgCl2, पीएच 7.4 ते 310 गी 320mOsm तगर समायोजित करो, ते 1mM 1-[1-13C] पाइरुवेट (Eurisotop, कैटलॉग नंबर CLM-1082) जोड़ो। खंडें गी 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिंट तगर इन्क्यूब करो। प्रयोग दे अंत च, खंडें गी 75 मिमी अमोनियम कार्बोनेट युक्त जलीय घोल (पीएच 7.4) कन्नै जल्दी धोया गेआ, ते फिर 40:40:20 (v:v:v) एसीटोनिट्राइल (ACN): मिथानल: पानी च समरूप कीता गेआ। खंडें गी बर्फ पर 30 मिंट तगर इन्क्यूब करने दे बाद नमूनें गी 21,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ, ते साफ सुपरनेटेंट गी स्पीडवैक कंसेन्ट्रेटर च सुक्खेआ गेआ। नतीजे च सूखी मेटाबोलाइट गोली गी विश्लेषण तगर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कीता गेआ।
13 सी-लेबल अमीनो एसिड दा तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) विश्लेषण आस्तै, मेटाबोलाइट गोली गी 75μl एलसी-एमएस ग्रेड पानी (हनीवेल) च फिरी लटकाया गेआ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तगर 21,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करने दे बाद अमीनो एसिड फ्लक्स विश्लेषण आस्तै 20 μl साफ सुपरनेटेंट दा इस्तेमाल कीता गेआ, जिसलै के बाकी अर्क दा तुरत आयन विश्लेषण आस्तै इस्तेमाल कीता गेआ (नीचे दिक्खो)। अमीनो एसिड विश्लेषण पैह् ले थमां वर्णत बेंजोइल क्लोराइड डेरिवेटाइजेशन प्रोटोकॉल ( 55 , 56 ) दा उपयोग करियै कीता गेआ। पैह् ले चरण च 10μl 100 mM सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) गी 20μl मेटाबोलाइट अर्क च पाया गेआ, ते उसदे बाद 10μl 2% बेंजोइल क्लोराइड (सिग्मा-एल्ड्रिच) गी एलसी ग्रेड एसीएन च पाया गेआ। नमूने गी संक्षेप च भंवर कीता गेआ ते उसदे बाद 21,000 ग्राम पर 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ। साफ कीते गेदे सुपरनेटेंट गी शंक्वाकार ग्लास इन्सर्ट (200 μl वॉल्यूम) कन्नै 2 मिलीलीटर आटोसैंपलर शीशी च स्थानांतरित करो। नमूनें दा विश्लेषण क्यू-एक्सएक्टिव (क्यूई)-एचएफ (अल्ट्रा हाई फील्ड ऑर्बिट्रैप) उच्च रिजोल्यूशन परिशुद्धता मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) कन्नै जुड़े दे एक्विटी आईक्लास अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस एलसी सिस्टम (वाटर्स) दा उपयोग करियै कीता गेआ। विश्लेषण आस्तै, व्युत्पन्न नमूने दा 2μl 100×1.0 मिमी उच्च ताकत आह् ले सिलिका T3 स्तंभ (पानी) च इंजेक्ट कीता गेआ जिस च 1.8μm कण होंदे न। प्रवाह दर 100μl/मिनट ऐ, ते बफर प्रणाली च बफर ए (पानी च 10 मिमी अमोनियम फार्मेट ते 0.15% फार्मिक एसिड) ते बफर बी (एसीएन) शामल न। ढाल इस चाल्ली ऐ: 0% बी 0 मिनट पर; 0% बी। 0 थमां 0.1 मिनट च 0 थमां 15% बी; 0.1 थमां 0.5 मिनट च 15 थमां 17% बी; बी 0.5 थमां 14 मिनट च 17 थमां 55%; बी 14 थमां 14.5 मिनट च 55 थमां 70%; 18 मिनट च 14.5 थमां 70 थमां 100% बी पर; 18 ते 19 मिनट च 100% बी; 19 थमां 19.1 मिनट च 100 थमां 0% बी; 19.1 ते 28 मिनट (55, 56) पर 0% बी। QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर 50 थमां 750 दी द्रव्यमान सीमा m/z (मास/चार्ज अनुपात) कन्नै सकारात्मक आयनीकरण मोड च कम्म करदा ऐ, लागू कीता गेआ रिजोल्यूशन 60,000 ऐ, ते हासल कीता गेआ लाभ नियंत्रण (AGC) आयन लक्ष्य 3×106 ऐ, ते ज़्यादातर आयन समें 100 मिलीसेकंड ऐ। गरम इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत 3.5 केवी स्प्रे वोल्टेज, 250 डिग्री सेल्सियस दे केशिका तापमान, 60 एयू (मनमानी इकाइयें) दे म्यान हवा दे प्रवाह ते 20 एयू दे सहायक हवा दे प्रवाह पर कम्म करदा ऐ। 250 डिग्री सेल्सियस होंदा ऐ। एस लेंस 60 एयू पर सेट कीता गेदा ऐ।
13C लेबल कार्बनिक अम्ल दा आयन क्रोमैटोग्राफी-एमएस विश्लेषण। बचे दे मेटाबोलाइट अवक्षेप (55μl) दा विश्लेषण डायोनेक्स आयन क्रोमैटोग्राफी प्रणाली (आईसीएस 5000+, थर्मो फिशर साइंटिफिक) दा उपयोग करियै कीता गेआ जेह् ड़ा क्यूई-एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) कन्नै जुड़े दा हा। संक्षेप च, 5μl मेटाबोलाइट अर्क गी 1. )on दे भरने दे अनुपात कन्नै पुश-इन आंशिक लूप मोड च एचपीएलसी (2 मिमी×250 मिमी, कण आकार 4μm, थर्मो फिशर साइंटिफिक) कन्नै लैस डायोनेक्स आयनपैक AS11-HC स्तंभ च इंजेक्ट कीता गेआ। डायोनेक्स आयनपैक एजी11-एचसी गार्ड कॉलम (2 मिमी x 50 मिमी, 4 माइक्रोन, थर्मो फिशर वैज्ञानिक)। स्तंभ दा तापमान 30 डिग्री सेल्सियस पर रक्खेआ जंदा ऐ, ते ऑटोसैंपलर गी 6 डिग्री सेल्सियस पर सेट कीता जंदा ऐ। इल्यूएंट जनरेटर दे माध्यम कन्नै पोटैशियम हाइड्रोक्साइड ढाल पैदा करने आस्तै विआयनीकृत पानी कन्नै उपलब्ध करोआए गेदे पोटैशियम हाइड्रोक्साइड कारतूस दा इस्तेमाल करो। 380μl/मिनट दी प्रवाह दर कन्नै मेटाबोलाइट्स दा पृथक्करण, निम्नलिखित ढाल लागू करना: 0 थमां 3 मिनट, 10 मिमी KOH; 3 थमां 12 मिनट, 10 थमां 50 मिमी केओएच; 12 थमां 19 मिनट, 50 थमां 100 मिमी केओएच; 19 ते 21 मिनट , 100 मिमी केओएच; 21 थमां 21.5 मिनट, 100 थमां 10 मिमी केओएच। स्तंभ गी 10 मिमी केओएच दे हेठ 8.5 मिनट तगर दुबारा संतुलित कीता गेआ।
इल्यूट कीते गेदे मेटाबोलाइट्स गी स्तंभ दे बाद 150μl/min आइसोप्रोपानोल पूरक धारा कन्नै जोड़ेआ जंदा ऐ ते उसदे बाद नकारात्मक आयनीकरण मोड च कम्म करने आह् ले उच्च रिजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर च ​​निर्देशत कीता जंदा ऐ। एमएस 60,000 दे रिजोल्यूशन कन्नै m/z 50 थमां 750 तगर दी मास रेंज दी निगरानी करा’रदा ऐ। एजीसी गी 1×106 पर सेट कीता जंदा ऐ, ते ज़्यादातर आयन समें गी 100 एमएस पर रक्खेआ जंदा ऐ। गरम कीते गेदे ईएसआई स्रोत गी 3.5 केवी दे स्प्रे वोल्टेज पर चलाया गेआ हा। आयन स्रोत दी होर सेटिंग्स इस चाल्लीं न: केशिका तापमान 275 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस प्रवाह, 60 एयू; सहायक गैस प्रवाह, 300 डिग्री सेल्सियस पर 20 एयू, ते एस लेंस 60 एयू पर सेटिंग।
13C लेबल मेटाबोलाइट्स दा डेटा विश्लेषण। आइसोटोप अनुपात दे डेटा विश्लेषण आस्तै ट्रेसफाइंडर सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) दा उपयोग करो। हर इक यौगिक दी पन्छान गी इक भरोसेमंद संदर्भ यौगिक कन्नै सत्यापन कीता गेआ ते स्वतंत्र रूप कन्नै विश्लेषण कीता गेआ। आइसोटोप संवर्धन विश्लेषण करने आस्तै हर 13C आइसोटोप (Mn) दे कड्ढे गेदे आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) दा क्षेत्रफल [M + H] + थमां कड्ढेआ गेआ हा, जित्थै n लक्ष्य यौगिक दी कार्बन संख्या ऐ, जिसदा इस्तेमाल अमीनो एसिड दा विश्लेषण करने लेई कीता जंदा ऐ जां [ MH] + दा उपयोग आयन दा विश्लेषण करने लेई कीता जंदा ऐ। एक्सआईसी दी द्रव्यमान सटीकता पंज भाग प्रति मिलियन थमां घट्ट ऐ, ते आरटी दी सटीकता 0.05 मिनट ऐ। समृद्धि विश्लेषण हर इक पता लाए गेदे समस्थानिक दे अनुपात दी गणना करियै कीता जंदा ऐ ते इसदे अनुरूप यौगिक दे सारे समस्थानिक दे योग कन्नै कीता जंदा ऐ। एह् अनुपात हर आइसोटोप आस्तै प्रतिशत मूल्यें दे रूप च दित्ते गे न , ते नतीजें गी मोलर प्रतिशत संवर्धन (एमपीई) दे रूप च दर्शाया गेआ ऐ , जि’यां पैह् ले वर्णत कीता गेआ ऐ ( 42 ) ।
जमे दे न्यूरॉन गोली गी बर्फ-ठंडे 80% मेथानॉल (v/v) च समरूप कीता गेआ, भंवर कीता गेआ, ते -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ। नमूने गी दुबारा भंवर करो ते +4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तगर हलचल करो। नमूने गी 21,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ, ते उसदे बाद नतीजे च सुपरनेटेंट गी इकट्ठा करियै बाद च विश्लेषण आस्तै 25 डिग्री सेल्सियस पर स्पीडवैक कंसेन्ट्रेटर दा उपयोग करियै सुक्खेआ गेआ। जि’यां केईं दस्सेआ गेआ ऐ, छंटाई कीते गेदे कोशिकाएं दे अमीनो एसिड उप्पर एलसी-एमएस विश्लेषण कीता गेआ। ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) दा उपयोग करदे होई हर इक यौगिक दे मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान दा उपयोग करियै डेटा विश्लेषण कीता गेआ। मेटाबोलाइट डेटा दा क्वांटाइल नॉर्मलाइजेशन प्रीप्रोसेसकोर सॉफ्टवेयर पैकेज ( 57 ) दा उपयोग करदे होई कीता गेआ।
स्लाइस की तैयारी। माउस गी जल्दी कार्बन डाइऑक्साइड कन्नै बेहोश कीता गेआ ते सिर कट्टेआ गेआ, दिमाग गी जल्दी खोपड़ी थमां कड्ढी लैता गेआ, ते बर्फ कन्नै भरोचे दे कंपन चाकू (एचएम-650 वी, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वालडॉर्फ, जर्मनी) दा इस्तेमाल करियै इसगी 300 थमां 375 माइक्रोन सैजिटल सेक्शनें च कटौती कीता गेआ ठंडा कार्बन गैसीकरण (95% O2 ते 5% CO2) कम Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फास्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 ते 6.0 mM MgCl2 पीएच 7.4 ते 310 थमां 330 mOsm तगर समायोजित करो)। प्राप्त मस्तिष्क स्लाइसें गी इक कक्ष च स्थानांतरित करो जिस च उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फास्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 4.0 mM CaCl2 ते mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ते 310 ते 320 एमओएसएम)। स्लाइसें गी 20 शा 30 मिंट तगर स्टोर करो तां जे रिकार्डिंग थमां पैह् ले उ’नेंगी बहाल कीता जाई सकै।
रिकार्डिंग करना। सब्भै रिकार्डिंगें लेई इक स्थिर रिकार्डिंग कक्ष ते 20x पानी च विसर्जन उद्देश्य लेंस (साइंटिफिका) कन्नै लैस माइक्रोस्कोप स्टेज दा इस्तेमाल कीता गेआ। कथित पुर्किन्जे कोशिकाएं दी पन्छान (i) शरीर दे आकार, (ii) सेरेब्रल दे शारीरिक स्थान, ते (iii) फ्लोरोसेंट mtYFP रिपोर्टर जीन दी अभिव्यक्ति कन्नै कीती गेई। 5 थमां 11 मेगोहम दी टिप प्रतिरोधक क्षमता आह् ला पैच पिपेट गी बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (जीबी150-10, 0.86 मिमी × 1.5 मिमी × 100 मिमी, साइंस प्रोडक्ट्स, होफहेम, जर्मनी) ते इक क्षैतिज पिपेट इंस्ट्रूमेंट्स (पी-1000, सटर), नोवाटो, सीए द्वारा बाहर कड्ढेआ जंदा ऐ। सब्भै रिकार्डिंग ELC-03XS npi पैच क्लैंप एम्पलीफायर (npi electronic GmbH, Tam, Germany) द्वारा कीती गेई ही, जिसगी सॉफ्टवेयर सिग्नल (संस्करण 6.0, कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक, कैम्ब्रिज, यूके) कन्नै नियंत्रत कीता गेआ हा। प्रयोग गी 12.5 किलोहर्ट्ज दी नमूनें दी दर कन्नै रिकार्ड कीता गेआ। सिग्नल गी दो शॉर्ट-पास बेसल फिल्टर कन्नै फ़िल्टर कीता जंदा ऐ जिंदी कटऑफ फ्रीक्वेंसी क्रमशः 1.3 ते 10 किलोहर्ट्ज होंदी ऐ। झिल्ली ते पिपेट दी समाई गी एम्पलीफायर दा उपयोग करदे होई मुआवजा सर्किट कन्नै मुआवजा दित्ता जंदा ऐ। सारे प्रयोग ओर्का-फ्लैश 4.0 कैमरे (हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) दे नियंत्रण च कीते गे, जेह् ड़ा होकावो सॉफ्टवेयर (संस्करण 2.8, हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) कन्नै नियंत्रित कीता गेआ हा।
नियमित रूप कन्नै पूरे कोशिका विन्यास ते विश्लेषण। रिकार्डिंग थमां फौरन पैह् ले पिपेट गी अंदरूनी घोल कन्नै भरो जिस च निम्नलिखित पदार्थ होंदे न: 4.0 मिमी केसीएल, 2.0 मिमी NaCl, 0.2 मिमी ईजीटीए, 135.0 मिमी पोटैशियम ग्लूकोनेट, 10.0 मिमी हेपेस, 4.0 मिमी एटीपी (Mg), 0.5 मिमी गुआनोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) (Na) ते 10.0 एमएम क्रिएटिनिन फास्फेट गी पीएच 7.25 तगर समायोजित कीता गेआ हा, ते आसमाटिक दबाव 290 एमओएसएम (सुक्रोज) हा। झिल्ली गी फाड़ने आस्तै 0 पीए दा बल लाने दे तुरंत बाद आराम करने आह् ली झिल्ली दी क्षमता गी मापा गेआ। इनपुट प्रतिरोध गी -40, -30, -20, ते -10 पीए दे हाइपरपोलर करंट लाने कन्नै मापा जंदा ऐ। वोल्टेज प्रतिक्रिया दी परिमाण गी मापने ते इनपुट प्रतिरोध दी गणना करने लेई ओम दे नियम दा उपयोग करो। स्वतःस्फूर्त गतिविधि गी 5 मिनट तगर वोल्टेज क्लैंप च रिकार्ड कीता गेआ हा, ते अर्ध-स्वचालित पन्छान स्क्रिप्ट दा उपयोग करियै इगोर प्रो (संस्करण 32 7.01, वेवमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगन, यूएसए) च एसपीएससी दी पन्छान ते मापने दा कम्म कीता गेआ। IV वक्रता ते स्थिर-स्थिति करंट गी बैटरी गी बक्ख-बक्ख विभवें पर क्लैंप करियै (-110 एमवी थमां शुरू) ते 5 एमवी चरणें च वोल्टेज बधाइयै मापा जंदा ऐ। एपी दे उत्पादन दा परीक्षण डिपोलराइजिंग करंट लाने कन्नै कीता गेआ। डिपोलराइजिंग करंट पल्स लागू करदे बेल्लै सेल गी -70 एमवी पर क्लैंप करो। हर रिकार्डिंग इकाई दे चरण आकार गी बक्ख-बक्ख (10 थमां 60 पीए) समायोजित करो। पल्स स्पाइकें गी मैन्युअल रूप कन्नै गिनती करियै मती थमां मती एपी आवृत्ति दी गणना करो जेह् ड़े सारें शा मती एपी आवृत्ति पैदा करदे न। एपी थ्रेशोल्ड दा विश्लेषण विध्रुवीकरण पल्स दे दुए डेरिवेटिव दा उपयोग करियै कीता जंदा ऐ जेह् ड़ा पैह् ले थमां गै इक जां मते एपी गी ट्रिगर करदा ऐ।
छिद्रित पैच विन्यास ते विश्लेषण। मानक प्रोटोकॉल दा उपयोग करदे होई छिद्रित पैच रिकार्डिंग करो। एटीपी- ते जीटीपी-मुक्त पिपेट दा इस्तेमाल करो जिस च निम्नलिखित घटक नेईं होन: 128 मिमी ग्लूकोनेट के, 10 मिमी केसीएल, 10 मिमी हेपेस, 0.1 मिमी ईजीटीए ते 2 मिमी एमजीसीएल2, ते पीएच 7.2 (केओएच दा इस्तेमाल करियै) च समायोजित करो। कोशिका झिल्ली दी अनियंत्रित पारगम्यता गी रोकने आस्तै अंतःकोशिकीय घोल च एटीपी ते जीटीपी गी छोड़ी दित्ता जंदा ऐ। पैच पिपेट गी छिद्रित पैच दा रिकार्ड हासल करने आस्तै एम्फोटेरिसिन युक्त आंतरिक घोल (लगभग 200 थमां 250 μg/ml; G4888, सिग्मा-एल्ड्रिच) कन्नै भरेआ जंदा ऐ। एम्फोटेरिसिन गी डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (अंतिम सांद्रता: 0.1 थमां 0.3%; डीएमएसओ; डी8418, सिग्मा-एल्ड्रिच) च घोल दित्ता गेआ। इस्तेमाल कीते गेदे डीएमएसओ दी सांद्रता दा अध्ययन कीते गेदे न्यूरॉन्स उप्पर कोई खास असर नेईं पेआ। पंचिंग प्रक्रिया दे दौरान चैनल प्रतिरोध (Ra) दी लगातार निगरानी कीती गेई, ते प्रयोग गी Ra ते एपी दे आयाम स्थिर होने दे बाद (20-40 मिनट) शुरू कीता गेआ। स्वतःस्फूर्त गतिविधि गी वोल्टेज ते/जां करंट क्लैंप च 2 थमां 5 मिनट तगर मापा जंदा ऐ। डेटा विश्लेषण इगोर प्रो (संस्करण 7.05.2, वेवमेट्रिक्स, यूएसए), एक्सेल (संस्करण 2010, माइक्रोसॉफ्ट कारपोरेशन, रेडमंड, यूएसए) ते ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 8.1.2, ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, ला जोला, सीए) दा उपयोग करियै कीता गेआ। संयुक्त राज्य अमेरिका)। अनायास एपी दी पन्छान करने लेई, इगोरप्रो दे न्यूरोमैटिक v3.0c प्लग-इन दा इस्तेमाल कीता जंदा ऐ। दित्ती गेदी थ्रेशोल्ड दा उपयोग करदे होई एपी दी स्वतः पन्छान करो, जेह् ड़ी हर रिकार्ड आस्तै व्यक्तिगत रूप कन्नै समायोजित कीती जंदी ऐ। स्पाइक अंतराल दा उपयोग करदे होई, ज़्यादा शा ज़्यादा तत्काल स्पाइक आवृत्ति ते औसत स्पाइक आवृत्ति कन्नै स्पाइक आवृत्ति निर्धारत करो।
पीएन आइसोलेशन। पैह् ले प्रकाशत प्रोटोकॉल दे अनुकूल होने कन्नै, पीएन गी माउस सेरेब्रल थमां इक निर्दिष्ट चरण च शुद्ध कीता गेआ ( 58 ) । संक्षेप च, सेरेब्रल गी विच्छेदन करियै बर्फ-ठंडे विघटन माध्यम च कीमा कीता गेआ [बिना HBSS Ca2+ ते Mg2+ दे, 20 mM ग्लूकोज, पेनिसिलिन (50 U/ml) ते स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 mg/ ml) कन्नै पूरक कीता गेआ], ते फिर माध्यम गी पपीते [HBSS, 1-cysteine·HCl कन्नै पूरक कीता गेआ (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर), पपीन (16 यू / मिलीलीटर) ते डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस I (डीएनएज I; 0.1 मिलीग्राम/एमएल)] 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तगर इलाज करो। पैह् ले ऊतकें गी एंजाइमी पाचन गी रोकने आस्तै कमरे दे तापमान पर अंडे दा बलगम (10 मिलिग्राम/एमएल), बीएसए (10 मिलीग्राम/एमएल) ते डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/एमएल) आह्ले HBSS माध्यम च धोओ, ते फिर HBSS माध्यम च जिस च 20 मिमी ग्लूकोज होंदा ऐ HBSS, पेनिसिलिन (50 U/ml), स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 mg/ml) ते धीरे-धीरे पीसना डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/एमएल) इकल कोशिकाएं गी रिलीज करदा ऐ । नतीजे च कोशिका निलंबन गी 70μm कोशिका छन्ना दे माध्यम कन्नै छानने दा कम्म कीता गेआ, फिर कोशिकाएं गी सेंट्रीफ्यूजेशन (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) कन्नै गोली मारेआ गेआ ते छंटाई माध्यम च फिरी निलंबित कीता गेआ [HBSS, 20 mM ग्लूकोज, 20% भ्रूण गोहे ) सीरम, पेनिसिलिन (50 U/ml) ते स्ट्रेप्टोमाइसिन कन्नै पूरक कीता गेआ (0.05 मिलीग्राम / मिलीलीटर)]; प्रोपिडियम आयोडाइड कन्नै कोशिकाएं दी व्यवहार्यता दा मूल्यांकन करना ते कोशिकाएं दे घनत्व गी 1×106 थमां 2×106 कोशिकाएं/एमएल तगर समायोजित करना। फ्लो साइटोमेट्री थमां पैह् ले निलंबन गी 50 माइक्रोन कोशिका छन्ना दे माध्यम कन्नै छानने दा कम्म कीता गेआ।
प्रवाह साइटोमीटर। कोशिका छंटाई गी 4 डिग्री सेल्सियस पर FACSAria III मशीन (बीडी बायोसाइंसेज) ते FACSDiva सॉफ्टवेयर (बीडी बायोसाइंसेज, संस्करण 8.0.1) दा उपयोग करियै कीता गेआ। कोशिका निलंबन गी ~2800 घटनाएं/सेकंड दी दर कन्नै 20 पीएसआई दे दबाव च 100 माइक्रोन नोजल दा उपयोग करियै छंटाई कीती गेई। चूंकि परंपरागत गेटिंग मापदंड (कोशिका आकार, बाइमोडल भेदभाव, ते बिखरने दी विशेषताएं) होर कोशिकाएं दे किस्में थमां पीएन दा सही अलगाव सुनिश्चित नेईं करी सकदे न, इस करियै गेटिंग रणनीति गी माइटोवाईएफपी + ते नियंत्रण माइटोवाईएफपी − चूहें च वाईएफपी तीव्रता ते ऑटोफ्लोरोसेंस दी सीधी तुलना दे आधार उप्पर सेट कीता जंदा ऐ वाईएफपी गी नमूने गी 488 एनएम लेजर लाइन कन्नै विकिरण करियै उत्तेजित कीता जंदा ऐ, ते 530/30 एनएम बैंड पास फिल्टर दा उपयोग करियै सिग्नल दा पता लाया जंदा ऐ। माइटोवाईएफपी+ चूहें च, रोसा26-माइटोवाईएफपी रिपोर्टर जीन दी सापेक्ष ताकत दा बी इस्तेमाल न्यूरॉन शरीर ते एक्सोन टुकड़े च भेद करने लेई कीता जंदा ऐ। 7-एएडी गी 561 एनएम पीले लेजर कन्नै उत्तेजित कीता जंदा ऐ ते मृत कोशिकाएं गी बाहर कड्ढने आस्तै 675/20 एनएम बैंडपास फिल्टर कन्नै पता लाया जंदा ऐ। इक गै समें च एस्ट्रोसाइट्स गी बक्ख करने आस्तै, कोशिका निलंबन गी ACSA-2-APC कन्नै दाग दित्ता गेआ, फिर नमूने गी 640 एनएम लेजर लाइन कन्नै विकिरण कीता गेआ, ते सिग्नल दा पता लाने आस्तै 660/20 एनएम बैंडपास फिल्टर दा इस्तेमाल कीता गेआ।
इकट्ठे कीते गेदे कोशिकाएं गी सेंट्रीफ्यूजेशन (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) कन्नै गोली बनाई गेई ते इस्तेमाल तगर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कीता गेआ। Mfn2cKO चूहें ते उंदे कूड़े दे पिल्लें गी इक गै दिन वर्गीकृत कीता जंदा ऐ तां जे प्रक्रिया च परिवर्तनशीलता घट्ट होई सकै । एफएसीएस डेटा प्रस्तुति ते विश्लेषण फ्लोजो सॉफ्टवेयर (फ्लोजो एलएलसी, एशलैंड, ओरेगन, यूएसए) दा उपयोग करियै कीता गेआ।
जि’यां केईं दस्सेआ गेआ ऐ (59), रियल-टाइम पीसीआर दा उपयोग बाद च एमटीडीएनए दी मात्रा निर्धारण आस्तै छंटाई कीते गेदे न्यूरॉन्स थमां डीएनए गी अलग करने लेई कीता जंदा ऐ। रेखीयता ते थ्रेशोल्ड संवेदनशीलता दा शुरू च बक्ख-बक्ख संख्या च कोशिकाएं पर qPCR चलाने कन्नै परीक्षण कीता गेआ हा। संक्षेप च, 50 मिमी ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.5), 1 मिमी ईडीटीए, 0.5% ट्वीन 20 ते प्रोटीनेज के (200 एनजी/एमएल) कन्नै युक्त लाइसिस बफर च 300 पीएन इकट्ठा करियै 55 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट तगर इन्क्यूब करो। कोशिकाएं गी होर 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तगर इन्क्यूब कीता गेआ तां जे प्रोटीनेज के दी पूरी चाल्लीं निष्क्रियता सुनिश्चित कीती जाई सकै, mt-Nd1 आस्तै विशिश्ट TaqMan जांच (थर्मो फिशर) दा उपयोग करियै, mtDNA गी 7900HT रियल-टाइम पीसीआर प्रणाली (थर्मो फिशर साइंटिफिक) च अर्ध-मात्रा पीसीआर कन्नै मापा गेआ। विज्ञान, कैटलॉग नंबर Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर AIVI3E8) ते 18S (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर Hs99999901_s1) जीन।
प्रोटीओम नमूना तैयार करना। घोल गी 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तगर गर्म करियै ते सोनिकेशन करियै, लाइसिस बफर च [6 एम गुआनिडीन क्लोराइड, 10 एमएम ट्राइस (2-कार्बोक्जिएथिल) फास्फीन हाइड्रोक्लोराइड, 10 मिमी क्लोरोएसीटामाइड ते 100 एमएम ट्राइस- एचसीएल च जमे दे न्यूरॉन गोलियां लाइज़ बायोरप्टर (डायजेनोड) पर 10 मिनट (30 सेकंड दा नाड़ी / 30 सेकंड दी विराम अवधि) पर। नमूने गी 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) च 1:10 पतला कीता गेआ, 300 एनजी ट्राइप्सिन सोने (प्रोमेगा) कन्नै मिलाया गेआ, ते पूरी चाल्लीं पाचन हासल करने आस्तै 37 डिग्री सेल्सियस पर रातीं-रात इन्क्यूब कीता गेआ। दूए दिन नमूने गी 20,000 ग्राम पर 20 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज कीता गेआ। सुपरनेटेंट गी 0.1% फार्मिक एसिड कन्नै पतला कीता गेआ, ते घोल गी स्व-निर्मित स्टेजटिप्स कन्नै नमक मुक्त कीता गेआ। नमूने गी स्पीडवैक उपकरण (एपेनडॉर्फ कंसेन्ट्रेटर प्लस 5305) च 45 डिग्री सेल्सियस पर सुक्खेआ गेआ, ते उसदे बाद पेप्टाइड गी 0.1% फार्मिक एसिड च निलंबित कीता गेआ। सारे नमूने इक गै व्यक्ति आसेआ इक गै समें च तैयार कीते गे। एस्ट्रोसाइट्स दे नमूनें दा विश्लेषण करने आस्तै, 4 μg डिसाल्ट पेप्टाइड्स गी टैंडम मास टैग (TMT10plex, कैटलॉग नंबर 90110, थर्मो फिशर साइंटिफिक) कन्नै लेबल कीता गेआ हा जिस च पेप्टाइड ते टीएमटी अभिकर्मक अनुपात 1:20 हा। टीएमटी लेबल आस्तै, 0.8 मिलीग्राम टीएमटी अभिकर्मक गी 70 μl निर्जल ACN च फिरी लटकाया गेआ, ते सूखे पेप्टाइड गी 9 μl 0.1 M TEAB (ट्राइएथिल अमोनियम बाइकार्बोनेट) च पुनर्गठित कीता गेआ, जिस च ACN च 7 μl TMT अभिकर्मक जोड़ेआ गेआ। एकाग्रता 43.75% ही। 60 मिनट दे ऊष्मायन दे बाद रिएक्शन गी 2 μl 5% हाइड्रोक्सीलामाइन कन्नै बुझाया गेआ। लेबल पेप्टाइड्स गी इकट्ठा करियै सुक्खेआ गेआ, 0.1% फार्मिक एसिड (एफए) दे 200μl च फिरी लटकाया गेआ, दो च बंडेआ गेआ, ते फिर स्व-निर्मित स्टेजटिप्स दा इस्तेमाल करियै नमक मुक्त कीता गेआ। अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ) दा उपयोग करदे होई, दो आधे च इक गी 130Å1.7μm C18 कणें कन्नै भरोचे दे 1 मिमी x 150 मिमी एक्विटी क्रोमैटोग्राफिक स्तंभ पर विभाजित कीता गेआ (पानी, कैटलॉग नंबर SKU: 186006935)। थर्मो फिशर वैज्ञानिक)। 30μl/मिनट दी प्रवाह दर कन्नै पेप्टाइडें गी बक्ख करो, 96 मिनट दे चरणबद्ध ढाल कन्नै 85 मिनट तगर 1% थमां 50% बफर बी गी बक्ख करो, 3 मिनट तगर 50% थमां 95% बफर बी तगर बक्ख करो, फिर 95 % बफर बी आस्तै 8 मिनट; बफर ए 5% एसीएन ते 10 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) ऐ, ते बफर बी 80% एसीएन ते 10 मिमी एबीसी ऐ। हर 3 मिनट च अंशें गी इकट्ठा करियै दो समूहें (1 + 17, 2 + 18 बगैरा) च मिलाइयै वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज च सुक्की लैओ ।
एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण ऐ। मास स्पेक्ट्रोमेट्री आस्तै, पेप्टाइड्स (नंबर r119.aq) गी 25 सेमी, 75 माइक्रोन अंदरूनी व्यास आह् ले PicoFrit विश्लेषणात्मक स्तंभ (नमें उद्देश्य लेंस, भाग संख्या PF7508250) पर 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ माध्यम (Dr. Maisch, mat) कन्नै लैस, EASY-nLC दा इस्तेमाल कीता गेआ 1200 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, जर्मनी)। स्तंभ गी 50 डिग्री सेल्सियस पर रक्खेआ गेआ। बफर ए ते बी क्रमशः 0.1% फार्मिक एसिड ते 80% एसीएन च 0.1% फार्मिक एसिड होंदे न। पेप्टाइड्स गी 65 मिनट तगर 6% थमां 31% बफर बी, ते 5 मिनट तगर 31% थमां 50% बफर बी दे चरणबद्ध ढाल कन्नै बक्ख कीता गेआ। इल्यूट कीते गेदे पेप्टाइडें दा विश्लेषण ऑर्बिट्रैप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर कीता गेआ। पेप्टाइड प्रीकरसर एम/जेड माप 350 थमां 1500 मी/जेड दी रेंज च 120,000 दे रिजोल्यूशन कन्नै कीता जंदा ऐ। 27% सामान्य टक्कर ऊर्जा दा उपयोग करदे होई, उच्च ऊर्जा सी ट्रैप डिसोसिएशन (HCD) क्लीवेज आस्तै 2 थमां 6 दी चार्ज स्थिति आह् ले सबनें थमां मजबूत पूर्ववर्ती गी चुनेआ जंदा ऐ। चक्र दा समां 1 एस पर सेट कीता गेदा ऐ। पेप्टाइड टुकड़े दा m/z मूल्य आयन जाल च 5×104 दे सबतूं घट्ट एजीसी लक्ष्य ते 86 एमएस दे ज़्यादातर इंजेक्शन समें दा उपयोग करियै मापा गेआ। विखंडन दे बाद, पूर्ववर्ती गी 45 एस लेई गतिशील बहिष्कार सूची च रक्खेआ गेआ। टीएमटी-लेबल पेप्टाइड्स गी 50 सेमी, 75 माइक्रोन एक्लेम पेपमैप स्तंभ (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर 164942) पर बक्ख कीता गेआ हा, ते माइग्रेशन स्पेक्ट्रा दा विश्लेषण उच्च क्षेत्र असममित तरंगरूप आयन (एफएआईएमएस) उपकरणें कन्नै लैस ऑर्बिट्रैप लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर कीता गेआ हा (थर्मो फिशर साइंटिफिक) −50 ते −70 वी दे दो मुआवजा वोल्टेज पर कम्म करदा ऐ सिंक्रनाइज़ेशन पूर्ववर्ती दे आधार उप्पर चुने गेदे MS3 दा उपयोग टीएमटी रिपोर्ट आयन सिग्नल मापने आस्तै कीता जंदा ऐ। पेप्टाइड पृथक्करण गी EASY-nLC 1200 पर, 90% रेखीय ढाल इल्यूशन दा उपयोग करदे होई, 6% थमां 31% बफर सांद्रता कन्नै कीता गेआ; बफर ए 0.1% एफए, ते बफर बी 0.1% एफए ते 80% एसीएन हा। विश्लेषणात्मक स्तंभ गी 50 डिग्री सेल्सियस पर चलाया जंदा ऐ। FAIMS मुआवजा वोल्टेज दे अनुसार मूल फाइल गी बंडने लेई FreeStyle (संस्करण 1.6, थर्मो फिशर साइंटिफिक) दा उपयोग करो।
प्रोटीन दी पन्छान ते मात्रा निर्धारण। इंटीग्रेटेड एंड्रोमेडा सर्च इंजन दा उपयोग करदे होई, मूल डेटा दा विश्लेषण MaxQuant संस्करण 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) दा उपयोग करियै कीता गेआ। Aequorea victoria थमां हासल Cre recombinase ते YFP अनुक्रमें दे अलावा, पेप्टाइड टुकड़े स्पेक्ट्रा माउस संदर्भ प्रोटीओम (Proteome ID UP000000589, मई 2017 च UniProt थमां डाउनलोड कीता गेआ) दे कैननिकल अनुक्रम ते आइसोफॉर्म अनुक्रम दी खोज कीती गेई। मेथियोनिन ऑक्सीकरण ते प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटाइलेशन गी चर संशोधन दे रूप च सेट कीता गेआ; सिस्टीन कार्बामोइल मिथाइलेशन गी निश्चित संशोधनें दे रूप च सेट कीता गेआ। पाचन पैरामीटर गी “विशिष्टता” ते “ट्रिप्सिन/पी” पर सेट कीता जंदा ऐ। प्रोटीन दी पन्छान आस्तै इस्तेमाल कीते जाने आह् ले पेप्टाइड ते रेजर पेप्टाइड दी घट्ट शा घट्ट संख्या 1 ऐ; अनोखे पेप्टाइड्स दी घट्ट शा घट्ट संख्या 0 ऐ पेप्टाइड मैप मिलान दी शर्तें दे तैह्त प्रोटीन दी पन्छान दर 0.01 ही। “दूआ पेप्टाइड” विकल्प सक्षम ऐ। बक्ख-बक्ख मूल फाइलें दे बश्कार सफल पन्छान स्थानांतरित करने लेई "रन दे बश्कार मिलान" विकल्प दा उपयोग करो. लेबल-मुक्त मात्रा निर्धारण (एलएफक्यू) (60) लेई एलएफक्यू न्यूनतम अनुपात गिनती 1 दा उपयोग करो। एलएफक्यू तीव्रता गी हर समें बिंदु पर घट्ट शा घट्ट इक जीनोटाइप समूह च घट्ट शा घट्ट दो मान्य मूल्यें आस्तै छानेआ जंदा ऐ , ते 1000 दी चौड़ाई कन्नै इक सामान्य वितरण थमां एक्सट्रैपोलेट कीता जंदा ऐ । 0.3 ते 1.8 थमां हेठ चली जाओ। एलएफक्यू दे नतीजें दा विश्लेषण करने लेई पर्सियस कंप्यूटिंग प्लेटफार्म (https://maxquant.net/perseus/) ते आर (https://r-project.org/) दा उपयोग करो। विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण ( 61 ) आस्तै लिम्मा सॉफ्टवेयर पैकेज थमां इक दो-तरफा मध्यम टी परीक्षण दा इस्तेमाल कीता गेआ। अन्वेषणात्मक डेटा विश्लेषण ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ते pheatmap दा उपयोग करियै कीता जंदा ऐ। टीएमटी आह् ले प्रोटीओमिक्स डेटा दा विश्लेषण मैक्सक्वांट संस्करण 1.6.10.43 दा उपयोग करियै कीता गेआ। यूनिप्रोट दे मानव प्रोटीओमिक्स डेटाबेस थमां कच्चे प्रोटीओमिक्स डेटा दी तलाश करो, जेह् ड़ा सितंबर 2018 च डाउनलोड कीता गेआ हा।विश्लेषण च निर्माता आसेआ उपलब्ध करोआए गेदे आइसोटोप शुद्धता सुधार कारक शामल न। विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण आस्तै आर च लिम्मा दा उपयोग करो। मूल डेटा, डेटाबेस खोज नतीजे, ते डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो ते नतीजे सारें गी डेटा सेट पन्छानने आह् ले PXD019690 कन्नै PRIDE पार्टनर रिपोजिटरी दे राहें ProteomeXchange गठबंधन च संग्रहीत कीता जंदा ऐ।
कार्यात्मक एनोटेशन विश्लेषण गी समृद्ध करदे न। 8 हफ्तें च सेट कीते गेदे डेटा दी कार्यात्मक एनोटेशन शर्तें दी समृद्धि गी निर्धारत करने आस्तै चातुर्य मार्ग विश्लेषण (QIAGEN) उपकरण दा इस्तेमाल कीता गेआ (चित्र 1)। संक्षेप च, एलसी-एमएस/एमएस (टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा विश्लेषण थमां हासल मात्रात्मक प्रोटीन सूची दा उपयोग निम्नलिखित फ़िल्टर मापदंडें कन्नै कीता जंदा ऐ: मस मस्कुलस गी प्रजाति ते पृष्ठभूमि दे रूप च चुनेआ जंदा ऐ, ते श्रेणी च 0.05 जां उस थमां घट्ट समृद्धि आस्तै बेंजामिन आसेआ समायोजित पी मूल्य गी महत्वपूर्ण मन्नेआ जंदा ऐ। इस ग्राफ आस्तै, समायोजित पी मूल्य दे आधार उप्पर हर क्लस्टर च शीर्शक पंज अतिरिक्त श्रेणियां दस्सियां ​​गेइयां न। मल्टीपल टी-टेस्ट दा उपयोग करदे होई, बेंजामिन, क्रिएगर, ते येकुतिएली (Q = 5%) दे दो चरणें दे रेखीय बूस्ट प्रोग्राम दा उपयोग करदे होई, हर श्रेणी च चिह्नित महत्वपूर्ण उम्मीदवारें पर समें-कोर्स प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण कीता जंदा ऐ, ते हर पंक्ति दा बक्ख-बक्ख विश्लेषण कीता जंदा ऐ। लगातार एसडी अपनाने दी लोड़ नेईं ऐ।
इस अध्ययन दे नतीजें दी तुलना प्रकाशत डेटाबेस कन्नै करने ते चित्र 1 च इक वेन आरेख पैदा करने आस्तै, असें मात्रात्मक प्रोटीन सूची गी माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशनें कन्नै जोड़ेआ ( 24 ) । आरेख पैदा करने लेई ऑनलाइन उपकरण Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) दा उपयोग करो।
प्रोटीओमिक्स विश्लेषण आस्तै इस्तेमाल कीती जाने आह् ली सांख्यिक प्रक्रियाएं दी विस्तृत जानकारी आस्तै कृपया सामग्री ते विधियें दे सरबंधत खंड दा संदर्भ लैओ । बाकी सारे प्रयोगें लेई, विस्तृत जानकारी इसदे अनुरूप किवंदती च दित्ती जाई सकदी ऐ। जदूं तकर एह् नेईं दस्सेआ गेआ ऐ, तां सारे डेटा औसत ± SEM दे रूप च व्यक्त कीते जंदे न, ते सारे सांख्यिक विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 8.1.2 सॉफ्टवेयर दा उपयोग करियै कीते गे हे।
इस लेख आस्तै पूरक सामग्री आस्तै कृपा करियै दिक्खो http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
एह् इक खुल्लै एक्सेस लेख ऐ जेह् ड़ा क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-व्यावसायिक लाइसेंस दी शर्तें दे तैह् त बंड कीता गेदा ऐ, जेह् ड़ा कुसै बी माध्यम च इस्तेमाल, वितरण ते प्रजनन दी अनुमति दिंदा ऐ, जदूं तगर अंतिम इस्तेमाल व्यावसायिक फायदे आस्तै नेईं ऐ ते आधार ऐ जे मूल कम्मै दा सही ऐ। हवाला।
नोट: अस तुसेंगी सिर्फ अपना ईमेल पता देने लेई आखने आं तां जे जिस माह् नू गी तुस पेज पर सिफारिश करदे ओ ओह् जानन जे तुस चाह्न्दे ओ जे ओह् ईमेल दिक्खन ते एह् स्पैम नेईं ऐ। अस कुसै बी ईमेल पते गी कैप्चर नेईं करगे।
इस सवाल दा इस्तेमाल इस गल्लै गी परखने लेई कीता जंदा ऐ जे तुस विजिटर ओ जां नेईं ते स्वचालित स्पैम जमा करने गी रोकने लेई कीता जंदा ऐ।
ई. मोटोरी, आई. अतानासोव, एसएमवी कोचन, के फोल्ज़-डोनाहुए, वी. सक्तिवेलू, पी. जियावालिस्को, एन.टोनी, जे.पुयाल, एन.-जी. लार्सन ने दी
बेकाबू न्यूरॉन्स दे प्रोटीओमिक्स विश्लेषण कन्नै पता चलेआ ऐ जे न्यूरोडीजनरेशन दा मुकाबला करने आस्तै मेटाबॉलिक प्रोग्राम सक्रिय होंदे न ।
ई. मोटोरी, आई. अतानासोव, एसएमवी कोचन, के फोल्ज़-डोनाहुए, वी. सक्तिवेलू, पी. जियावालिस्को, एन.टोनी, जे.पुयाल, एन.-जी. लार्सन ने दी
बेकाबू न्यूरॉन्स दे प्रोटीओमिक्स विश्लेषण कन्नै पता चलेआ ऐ जे न्यूरोडीजनरेशन दा मुकाबला करने आस्तै मेटाबॉलिक प्रोग्राम सक्रिय होंदे न ।
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