वर्तमान†वर्तमान पता: OX11 0DE, यूके, डायमंड बिल्डिंग, हार्वेल साइंस एंड इनोवेशन पार्क, डायटकोट, ऑक्सफोर्डशायर, यूके, डायमंड लाइट सोर्स कंपनी, लिमिटेड, इलेक्ट्रॉनिक जैविक इमेजिंग सेंटर।
रिएक्शन सेंटर लाइट-हार्वेस्टिंग कॉम्प्लेक्स 1 (RC-LH1) बैंगनी प्रकाश संश्लेषण घटक ऐ। अस रोडोप्स्यूडोमोनास पैलुस्ट्रिस थमां आरसी-एलएच1 परिसर दी दो क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचनाएं गी पेश कीता। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर दी 2.65-Å रिजोल्यूशन संरचना च आरसी दे आसपास 14 सब-यूनिट एलएच1 लूप होंदे न, जेह् ड़े प्रोटीन डब्ल्यू कन्नै बाधित होंदे न, जिसलै के प्रोटीन-डब्ल्यू दे बगैर परिसर आरसी कन्नै घिरी दी पूरी चाल्ली आरसी संरचना ऐ। बंद 16 सबयूनिट एलएच 1 लूप। इनें संरचनाएं दी तुलना कन्नै आरसी-एलएच1 परिसर च क्विनोन दी गतिशीलता दे बारे च जानकारी दित्ती जंदी ऐ, जिंदे च आरसी क्यूबी साइट पर क्विनोन गी बन्नी लैंदे बेल्लै पैह् ले थमां गै अनिर्धारित संरचना च बदलाव, ते कन्नै गै सहायक क्विनोन बंड साइटें दा स्थान बी शामल ऐ, जेह् ड़े उनेंगी आरसी च पास करने च मदद करदे न। डब्ल्यू प्रोटीन दी अनोखी संरचना एलएच 1 लूप दे बंद होने गी रोकदी ऐ, जिस कन्नै क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज गी तेज करने आस्तै इक चैनल पैदा होंदा ऐ।
प्रकाश संश्लेषण कन्नै दित्ती जाने आह् ली ऊर्जा धरती पर लगभग सारे जीवन गी बरकरार रक्खी सकदी ऐ, ते इस च सौर जैव प्रौद्योगिकी दी बड़ी मती संभावना ऐ। वैश्विक प्रकाश संश्लेषण गी बढ़ावा देने दे कन्नै-कन्नै बैंगनी प्रकाश संश्लेषण दे बक्ख-बक्ख ऊर्जा दे तरीके ते चयापचय क्षमताएं गी बी प्रदर्शत करदे न। एह् प्रकाश संश्लेषण थमां बची सकदे न ते न्हेरे च विषम जीवाणुएं दे रूप च बध सकदे न , नाइट्रोजन ते कार्बन डाइऑक्साइड गी ठीक करी सकदे न , हाइड्रोजन पैदा करी सकदे न , ते सुगंधित यौगिकें गी विघटन करी सकदे न ( 1-3 ) । इनें प्रक्रियाएं लेई ऊर्जा उपलब्ध करोआने लेई प्रकाश गी जल्दी ते कुशलता कन्नै रसायन ऊर्जा च बदलना जरूरी ऐ। एह् प्रक्रिया उसलै शुरू होंदी ऐ जिसलै प्रकाश फंसे दा एंटीना परिसर प्रकाश गी सोखदा ऐ ते फंसे दी ऊर्जा गी रिएक्शन सेंटर (आरसी) च स्थानांतरित करदा ऐ, जिस कन्नै चार्ज पृथक्करण शुरू होंदा ऐ (4 – 7)। बैंगनी प्रकाश संश्लेषण दी बुनियादी इकाई टाइप 2 आरसी कन्नै बनी दी ऐ, जेह्ड़ी प्रकाश-कटाई परिसर 1 (LH1) कन्नै घिरी दी ऐ, जेह्ड़ी आरसी-एलएच1 कोर परिसर बनांदी ऐ। LH1 घुमावदार αβ हेटरोडाइमर दी सरणी कन्नै बने दा ऐ, जिंदे चा हर इक दो बैक्टीरियल क्लोरोफिल (BChl) इक अणु ते इक जां दो कैरोटीनॉइड (8-12) गी बन्नी लैंदा ऐ। सबनें शा सरल LH1 एंटीना च 16 जां 17 αβ हेटरोडाइमर होंदे न जेह्ड़े आरसी (9-13) गी बंद लूप च घेरदे न, पर होर कोर परिसरें च, ट्रांसमेम्ब्रेन पेप्टाइड्स आसपास दे LH1 दी निरंतरता गी बाधित करदे न , जिस कन्नै आरसी ते साइटोक्रोम bc1 परिसर (11, 11) दे बश्कार क्विनोल/क्विनोन प्रसार गी बढ़ावा दित्ता जंदा ऐ। १३-१५) दा)। बैंगनी रंग दा फोटोट्रोफिक पौधा रोडोप्स्यूडोमोनास (Rps.) इक माडल जीव ऐ जेह् ड़ा ऊर्जा ते इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण गी समझी सकदा ऐ जेह् ड़ा प्रकाश संश्लेषण दा समर्थन करदा ऐ। आरपीएस दी पैह्ली क्रिस्टलीय संरचना। पैलुस्ट्रिस आरसी-एलएच1 परिसर दा माडल आरसी ऐ, जेह्ड़ा 15 हेटरोडाइमेरिक एलएच1 लूपें कन्नै घिरे दा ऐ, जेह्ड़े “प्रोटीन डब्ल्यू” नांऽ दे इक अज्ञात प्रोटीन कन्नै बाधित होंदे न (14) । प्रोटीन-डब्ल्यू गी बाद च आरपीए4402 दे रूप च पन्छानेआ गेआ, जेह्ड़ा त्रै अनुमानित ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स (टीएमएच) कन्नै इक अचरित्र 10.5kDa प्रोटीन ऐ (16)। अस प्रोटीन डब्ल्यू गी एन्कोडिंग करने आह् ले rpa4402 जीन दा नांऽ बदलने दा प्रस्ताव रखने आं तां जे आरसी-एल, एम (pufL, pufM) ते LH1α, β (pufA, pufB) उप-इकाइयें गी एन्कोड करने आह् ले जीन आस्तै इस्तेमाल कीते गेदे नामकरण कन्नै मेल खंदा ऐ। मजेदार गल्ल एह् ऐ जे प्रोटीन-डब्ल्यू आरसी-एलएच1 दे लगभग 10% च गै मौजूद ऐ, जिस कन्नै आरपीएस दा पता चलदा ऐ। palustris दो बक्ख-बक्ख आरसी-एलएच1 परिसर पैदा करदा ऐ। इत्थें, अस दो कोर परिसरें दी उच्च रिजोल्यूशन क्रायो-ईएम (क्राइओ-ईएम) संरचनाएं दी रिपोर्ट करदे आं, इक प्रोटीन डब्ल्यू ते 14 αβ हेटरोडाइमर कन्नै, दूआ प्रोटीन डब्ल्यू दे बगैर ते इक बंद 16 हेटरोडाइमर एलएच1 लूप। साढ़ी संरचना आरपीएस दे आरसी-एलएच1 परिसर दी समझ च इक कदम बदलाव दा प्रतिनिधित्व करदी ऐ। palustris, कीजे असें हर वेरिएंट दी समरूप आबादी दा विश्लेषण कीता ऐ ते हर पेप्टाइड ते बद्ध रंजक ते सरबंधत लिपिड ते क्विनोन गी साफ तौर पर असाइन करने आस्तै पर्याप्त रिजोल्यूशन ऐ। इनें संरचनाएं दी तुलना कन्नै पता चलदा ऐ जे त्रै टीएमएच प्रोटीन-डब्ल्यू जेह् ड़े अजें तगर कुसै होर आरसी-एलएच1 परिसर च नेईं मिले न, क्विनोन/क्विनोलोन आदान-प्रदान गी तेज करने आस्तै इक क्विनोन चैनल पैदा करदे न। संरक्षित लिपिड ते क्विनोन बंड साइटें दी इक किस्म दी पंछान कीती गेई ऐ, ते असें क्विनोन ते आरसी दे संयोजन दे बाद इक नमें संरचना च बदलाव दा पता लाया ऐ, जेह् ड़ा आक्सीजनयुक्त फोटोट्रोफिक जीवें दे फोटोसिस्टम II (पीएसआईआई) आरसी आस्तै उपयुक्त होई सकदा ऐ। साढ़े निष्कर्ष बैंगनी फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया दे आरसी-एलएच1 कोर परिसर च क्विनोन/क्विनोलोन बंड ते एक्सचेंज दी गतिकी दे बारे च नमीं जानकारी दिंदे न।
आरपीएस च पाये गेदे दो परिसरें दे विस्तृत अध्ययन दी सुविधा आस्तै। palustris, अस हर आरसी-एलएच1 गी जैव रासायनिक तरीके कन्नै अलग करदे न। प्रोटीन डब्ल्यू-कमी परिसर (इसदे बाद ΔpufW आखेआ जंदा ऐ) गी pufW जीन (16) दी कमी आह् ले तनाव थमां शुद्ध कीता गेआ हा, ते सिर्फ इक आरसी-एलएच1 परिसर पैदा कीता जाई सकदा ऐ। प्रोटीन डब्ल्यू युक्त परिसर इक तनाऽ कन्नै पैदा होंदा ऐ । इस तनाऽ दे प्रोटीन डब्ल्यू गी इसदे सी-टर्मिनस पर 10x His टैग कन्नै संशोधित कीता जंदा ऐ, तां जे प्रोटीन डब्ल्यू युक्त परिसर गी धातु गी स्थिर करियै मते सारे कमी आह्ले प्रोटीन डब्ल्यू कन्नै प्रभावी ढंगै कन्नै जोड़ेआ जाई सकै। परिसर गी प्रभावी ढंगै कन्नै बक्ख कीता जंदा ऐ (16) एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी (आईएमएसी)।
जि’यां चित्र 1 च दिक्खेआ गेआ ऐ, दौनें परिसरें च त्रै उप-इकाई आरसी (आरसी-एल, आरसी-एम ते आरसी-एच) ऐ जेह् ड़ा एलएच 1 एंटीना कन्नै घिरे दा ऐ। प्रोटीन-डब्ल्यू दी कमी आह् ले परिसर दी 2.80-ए संरचना 16 αβ हेटरोडाइमर दस्सदी ऐ, जेह् ड़ी आरसी गी पूरी चाल्लीं कन्नै घेरने आह् ला इक बंद LH1 लूप बनांदी ऐ, जिसगी इसदे बाद आरसी-एलएच116 परिसर आखेआ जंदा ऐ। प्रोटीन-डब्ल्यू युक्त परिसर दी 2.65Å संरचना च प्रोटीन-डब्ल्यू द्वारा बाधित 14-हेटरोडाइमर एलएच 1 होंदा ऐ, जिसगी इसदे बाद आरसी-एलएच114-डब्ल्यू आखेआ जंदा ऐ।
(ए ते बी) यौगिक दा सतह दा प्रतिनिधित्व। (सी ते डी) छड़ें च व्यक्त कीते गेदे बंधे रंजक। (ई ते एफ) साइटोप्लाज्मिक सतह थमां दिक्खे गेदे परिसरें च पेप्टाइड ते एलएच 1 उप-इकाइयां कार्टूनें च दर्शाए गेदे न, ते प्रोटीन-डब्ल्यू गैप थमां घड़ी दी दिशा च नंबर दित्ते गेदे न [आरबीए नंबरिंग कन्नै मेल खंदा ऐ। स्फेरोइड्स परिसर (13)]। LH1-α आस्तै, प्रोटीन उप-इकाई दा रंग पीला होंदा ऐ; LH1-β आस्तै, प्रोटीन उप-इकाई दा रंग नीला ऐ; प्रोटीन-डब्ल्यू आस्तै, प्रोटीन लाल होंदा ऐ; आरसी-एच आस्तै, एह् सियान ऐ; आरसी-एल आस्तै, एह् ऑरेंज ऐ; आरसी-एम, मैजेंटा दे लेई। कोफैक्टरें गी छड़ें कन्नै दर्शाया जंदा ऐ , हरे रंग BChl ते BPh a अणुएं दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ , बैंगनी रंग कैरोटीनॉइड्स दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ , ते पीला रंग UQ10 अणुएं दा प्रतिनिधित्व करदा ऐ । (जी ते एच) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (जी) ते आरसी-एलएच116 परिसर (एच) दे समतुल्य क्षेत्र च प्रोटीन-डब्ल्यू अंतराल दा संवर्धित दृश्य। कोफैक्टरें गी स्पेस भरने दे रूप च प्रदर्शत कीता जंदा ऐ, किलेटेड क्विनोन गी नीले रंग च प्रदर्शत कीता जंदा ऐ। प्रोटीन-डब्ल्यू अंतराल गी (जी) च नीली डैश रेखा कन्नै उजागर कीता गेआ ऐ, ते छोटे छेद जित्थें एलएच116 रिंग पर क्विनोन/क्विनोलोल फैलदा ऐ, (एच) च काली डैश रेखा कन्नै उजागर कीता गेआ ऐ।
चित्र 1 (ए ते बी) LH1αβ हेटरोडाइमर दी खुल्लियै जां बंद सरणी कन्नै घिरे दा आरसी दस्सदा ऐ, जिंदे चा हर इक दो बीसीएचएल ते इक कैरोटीनॉइड गी बन्नी लैंदा ऐ (चित्र 1, सी ते डी)। पिछले अध्ययनें कन्नै पता चलेआ ऐ जे आरपीएस एलएच 1 परिसर ऐ। स्पाइरुलिना ज़ैन्थिन दे जैव संश्लेषण मार्ग च इनें प्रजातियें च कैरोटीनॉइड्स दी मिश्रित आबादी होंदी ऐ ( 17 ) । हालांकि, स्पाइरोपाइरोक्सैन्थिन प्रबल कैरोटीनॉइड ऐ ते इसदा घनत्व संतोषजनक ऐ। इसलेई, असें सारे LH1 बाइंडिंग साइटें पर स्पाइरोक्सैन्थिन दा मॉडलिंग करना चुनेआ। अल्फा ते बीटा पॉलीपेप्टाइड इकल टीएमएच न जिंदे च छोटे झिल्ली दे बाहरी क्षेत्र होंदे न (चित्र 1, ए, बी, ई, ते एफ)। हालांकि सी-टर्मिनस पर 17 अवशेषें दा घनत्व नेईं दिक्खेआ गेआ, पर अल्फा पॉलीपेप्टाइड गी दौनें परिसरें च Met1 थमां Ala46 तगर विभाजित कीता गेआ। β पॉलीपेप्टाइड गी आरसी-एलएच116 च Gly4 थमां Tyr52 च, ते आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च Ser5 थमां Tyr52 च घट्ट कीता गेआ। 3 जां 4 एन-टर्मिनल जां 13 सी-टर्मिनल अवशेषें दा कोई घनत्व नेईं दिक्खेआ गेआ (चित्र S1)। जंगली किस्म दे तनाव थमां तैयार कीते गेदे मिश्रित आरसी-एलएच1 परिसर दे मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण कन्नै पता चलेआ जे लापता क्षेत्र इनें पेप्टाइड्स दे विषम विच्छेदन दा नतीजा ऐ (चित्र S1 ते S2)। α-Met1 दा एन-टर्मिनल फॉर्मिलेशन बी दिक्खेआ गेआ (च)। विश्लेषण च दस्सेआ गेआ ऐ जे α-पेप्टाइड च अवशेष fMet1 थमां Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 होंदे न, ते β-पेप्टाइड च अवशेष Ser2 थमां Ala53 होंदे न, जेह् ड़े घट्ट तापमान आह् ले ईएम घनत्व नक्शे कन्नै खरी चाल्ली सहमत न।
α-His29 ते β-His36 दा समन्वय BChls गी आमने सामने बनांदा ऐ; हर αβ हेटरोडाइमर अपने पड़ोसी कन्नै इकट्ठा होंदा ऐ ते आरसी दे आसपास इक खुल्ला लूप (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू) जां इक बंद लूप (आरसी-एलएच116) बनांदा ऐ एक्साइटन युग्मित रंजक सरणी (चित्र 1, सी ते डी)। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू दे 877 एनएम बैंड दी तुलना च, आरसी-एलएच116 दा 880 एनएम अवशोषण लाल शिफ्ट 3 एनएम ऐ (चित्र 2 ए)। पर, गोलाकार द्विगुणित स्पेक्ट्रम लगभग इक गै ऐ (चित्र 2 बी), जेह् ड़ा इस गल्लै गी दस्सा करदा ऐ जे हालांकि खुल्ले ते बंद लूपें च साफ अंतर ऐ, पर बीसीएचएल दा मकामी वातावरण बड़ा समान ऐ। अवशोषण रेडशिफ्ट बंद लूप (18, 19) पर थर्मल गति च कमी ते स्थिरता च वृद्धि दा नतीजा हो सकदा ऐ, बंद लूप (20, 21) दे कारण रंजक युग्मन च बदलाव, जां इनें दो प्रभावें दा संयोजन (11) होई सकदा ऐ।
(ए) पराबैंगनी/दृश्यमान/नियर-इन्फ्रारेड अवशोषण स्पेक्ट्रम, जिसदे चोटियें गी उंदे अनुरूप रंजक कन्नै चिन्नत कीता जंदा ऐ ते 775 एनएम पर बीपीएच चोटी पर सामान्य कीता जंदा ऐ। (B) 805 एनएम पर बीसीएचएल अवशोषण गी सामान्य कीता गेआ गोलाकार द्विवर्णता स्पेक्ट्रम। (सी ते डी) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (सी) ते आरसी-एलएच116 परिसर (डी) दे समें-रिजोल्यूशन अवशोषण स्पेक्ट्रा थमां चयनित ΔA स्पेक्ट्रा। बेहतर तुलनात्मकता आस्तै, सारे स्पेक्ट्रा गी 0.2 पीएस पर −A दे ∆A तगर सामान्य कीता जंदा ऐ। (ई) UQ2 दी बक्ख-बक्ख सांद्रता दी मौजूदगी च विकिरण दे बाद साइटोक्रोम c2 आक्सीजन दी दर (कच्चे आंकड़ें लेई चित्र S8 दिक्खो)। (F) निम्न, मध्यम जां उच्च तीव्रता आह् ली रोशनी (क्रमशः 10, 30 जां 300μMm-2 s-1) दे हेठ उगने आह् ले कोशिकाएं च, शुद्ध परिसर च प्रोटीन डब्ल्यू ते आरसी-एल उप-इकाइयें ते बक्ख-बक्ख झिल्ली अनुपात च। एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस ते इम्यूनोएसे द्वारा प्रोटीन दे स्तर दा निर्धारण करो (कच्चे डेटा आस्तै चित्र S9 दिक्खो)। शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर दे सापेक्ष अनुपात निर्धारत करो। परिसर दे आरसी-एल ते प्रोटीन-डब्ल्यू दा स्टोइकियोमेट्रिक अनुपात 1:1 ऐ।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (चित्र 1, ए, सी, ते ई) दे विकृत αβ14 लूप च स्थिति 1 पर बीसीएचएल आरसी-एलएच116 च समतुल्य बीसीएचएल दी तुलना च 6.8Å आरसी प्राथमिक दाता (पी) दे नेड़े न (चित्र 1, बी, डी, ते एफ, ते चित्रा S3); हालांकि, दो परिसरें दी क्षणिक अवशोषण गतिकी दस्सदी ऐ जे आरसी-एलएच114-डब्ल्यू ते आरसी-एलएच116 आस्तै, एलएच1 थमां आरसी तगर उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण समें स्थिरांक 40 ±4 ते 44±3 पीएस न (चित्र 2)। , सी ते डी, चित्रा एस 4 ते तालिका एस 2)। आरसी दे अंदर इलेक्ट्रानिक हस्तांतरण च बी कोई खास फर्क नेईं ऐ (चित्र S5 ते इसदे कन्नै सरबंधत पूरक पाठ)। असेंगी शक ऐ जे एलएच 1 ते आरसी-पी दे बश्कार ऊर्जा हस्तांतरण समें दा निकटता दा कारण ऐ जेह् ड़ा दो एलएच 1 लूपें च मते सारे बीसीएचएल दी समान दूरी, कोन ते संभावित ऊर्जा ऐ। ऐसा लगदा ऐ जे घट्ट शा घट्ट दूरी तगर पुज्जने आस्तै एलएच 1 ऊर्जा पैटर्न दी खोज करना सब-ऑप्टिमल साइटें थमां आरसी च सीधे ऊर्जा हस्तांतरण थमां तेज नेईं ऐ। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च खुल्लै-लूप एलएच1 लूप संरचनात्मक विश्लेषण आस्तै घट्ट तापमान दी स्थिति च बी महत्वहीन तापीय गति थमां गुजरी सकदा ऐ, ते आरसी 1 दी स्थिति च βBChls दी रंजक दूरी थमां कमरे दे तापमान पर इक लम्मी αβ14 रिंग संरचना होंदी ऐ।
आरसी-एलएच116 परिसर च 32 बीसीएचएल ते 16 कैरोटीनॉइड्स होंदे न, ते इसदी समग्र व्यवस्था थर्मोक्रोमैटियम (Tch.) पिडपिडम [प्रोटीन डाटा बैंक (पीडीबी) आईडी 5Y5S] (9), थायोरोडोविब्रिओ (Trv.) 970 तनाव ( पीडीबी आईडी 7C9R) (12) ते हरे रंग थमां हासल कीती गेदी व्यवस्था दे समान ऐ शैवाल (Blc.viridis) (पीडीबी आईडी 6ET5) (10)। संरेखण दे बाद, αβ हेटरोडाइमर दी स्थिति च सिर्फ छोटे-छोटे विचलन दिक्खे गे, खासतौर पर 1-5, 15, ते 16 (चित्र S6)। प्रोटीन-डब्ल्यू दी मौजूदगी दा एलएच 1 दी संरचना पर मता असर पौंदा ऐ। इसदे त्रै टीएमएच छोटे लूपें कन्नै जुड़े दे न, जिंदे च एन-टर्मिनल परिसर दे लुमेन पास्से ते सी-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर होंदा ऐ (चित्र 1 ए ते 3, ए थमां डी)। प्रोटीन-डब्ल्यू बड्डे पैमाने पर हाइड्रोफोबिक ऐ (चित्र 3 बी), ते TMH2 ते TMH3 LH1αβ-14 कन्नै परस्पर क्रिया करियै इक ट्रांसमेम्ब्रेन सतह बनांदे न (चित्र 3, बी ते ई थमां जी)। इंटरफेस मुख्य रूप कन्नै ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र च Phe, Leu ते Val अवशेषें कन्नै रचे दा ऐ। एह् अवशेष हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड ते αβ-14 रंजक कन्नै ढेर होंदे न। किश ध्रुवीय अवशेष बी इस परस्पर क्रिया च योगदान दिंदे न, जिंदे च जटिल गुहा दी सतह पर W-Thr68 ते β-Trp42 दे बश्कार हाइड्रोजन बंड बी शामल ऐ (चित्र 3, एफ ते जी)। कोशिका द्रव्य दी सतह उप्पर, Gln34 αβ-14 कैरोटीनॉइड्स दे कीटो समूह कन्नै सटे दा ऐ। इसदे अलावा, एन-डोडेसिल β-डी-माल्टोसाइड (β-डीडीएम) अणु गी हल कीता गेआ हा, ते इसदी हाइड्रोफोबिक पूंछ प्रोटीन-डब्ल्यू ते αβ-14 दे बश्कार इंटरफेस तगर फैली गेई ही, ते लिपिड पूंछ शरीर च स्थित होई सकदी ऐ। असें एह् बी दिक्खेआ जे प्रोटीन डब्ल्यू ते आरसीएच दे सी-टर्मिनल रिजोल्यूशन क्षेत्र मते नेड़े न, पर विशिष्ट परस्पर क्रियाएं बनाने दे दायरे च नेईं न (चित्र 1, ए ते ई)। लेकन इनें दऊं प्रोटीनें दे अनसुलझे सी-टर्मिनल अमीनो एसिड च परस्पर क्रियाएं हो सकदियां न, जेह् ड़े आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर दी असेंबली दौरान प्रोटीन-डब्ल्यू दी भर्ती आस्तै इक तंत्र प्रदान करी सकदे न।
(ए) प्रोटीन-डब्ल्यू, जेह् ड़ा कार्टून रूप च LH1αβ14 कन्नै इंटरफेस दा सामना करदा ऐ, च रॉड आह् ली साइड चेन (लाल) ऐ, जेह् ड़ी इलेक्ट्रोस्टैटिक पोटेंशियल आरेख दे इक हिस्से च प्रदर्शत होंदी ऐ (0.13 दे समोच्च स्तर कन्नै पारदर्शी ग्रे सतह)। (B) प्रोटीन-डब्ल्यू जिसदा प्रतिनिधित्व इक हाइड्रोफोबिक रंगीन सतह कन्नै कीता जंदा ऐ। ध्रुवीय ते चार्ज कीते गेदे इलाकें गी सियान च प्रदर्शत कीता गेआ ऐ, हाइड्रोफोबिक इलाकें गी सफेद रंग च प्रदर्शत कीता गेआ ऐ, ते मजबूती कन्नै हाइड्रोफोबिक इलाकें गी नारंगी रंग च प्रदर्शत कीता गेआ ऐ। (सी ते डी) प्रोटीन-डब्ल्यू कार्टून च दर्शाया गेआ ऐ, इसदा उन्मुखीकरण (ए) (सी) च होने आह् ला ऐ, ते 180° (डी) कन्नै घुमाया गेआ ऐ। अनुक्रम च स्थिति दे अनुसार, भेद करने योग्य अवशेष इंद्रधनुषी रंग योजना अपनांदे न, जित्थें एन-टर्मिनल नीला ते सी-टर्मिनल लाल होंदा ऐ। (ई) प्रोटीन-डब्ल्यू (ए) दे समान दृष्टिकोण च, ते प्रोटीन-डब्ल्यू:एलएच1 दे इंटरफेस पर अवशेषें गी संलग्न निशान कन्नै छड़ें कन्नै दर्शाया गेआ ऐ। (F) प्रोटीन-डब्ल्यू कार्टून प्रतिनिधित्व च (ई) ते LH1αβ14 दे सापेक्ष 90° घुमाया जंदा ऐ, ते बार प्रतिनिधित्व च इंटरफेस अवशेषें दे सापेक्ष। बीटा पॉलीपेप्टाइड थमां ओवरहैंगिंग अवशेषें गी लेबल कीता जंदा ऐ। कोफैक्टर गी चित्र 1 दे रंग कन्नै मेल खंदा बार दे रूप च दस्सेआ गेआ ऐ, सड़ने आह् ले β-डीडीएम गी ग्रे च दस्सेआ गेआ ऐ, ते आक्सीजन गी लाल रंग च दस्सेआ गेआ ऐ। (G) (F) च दृश्य 180° घुमाया जंदा ऐ, जिस च लेबल कीते गेदे अल्फा पॉलीपेप्टाइड दे प्रमुख अवशेष न।
प्रोटीन-डब्ल्यू इक αβ हेटरोडाइमर (चित्र 1F च 15वें) दी जगह लैंदा ऐ, जिस कन्नै लूप बंद होने ते पैह् ले त्रै αβ हेटरोडाइमर गी झुकाने थमां रोकेआ जंदा ऐ। एह् दिक्खेआ गेआ जे फिल्म सामान्य दे सापेक्ष पैह् ले αβ-1 हेटरोडाइमर दा अधिकतम झुकाव कोन 25° थमां 29° (चित्र 1, ए ते ई) हा, जेह्ड़ा आरसी ए तेज कंट्रास्ट-एलएच116 च αβ-1 दे 2° थमां 8° झुकाव कन्नै बने दा हा (चित्र 1, बी ते एफ)। दूआ ते त्रीया हेटरोडाइमर क्रमशः 12° थमां 22° ते 5° थमां 10° पर झुके दे न। आरसी दी स्टेरिक बाधा दे कारण, αβ-1 दे झुकाव च αβ दी दूई जोड़ी (जेह् ड़ी चित्र 1F च 16मीं αβ कन्नै मेल खंदा ऐ) शामल नेईं ऐ, इस चाल्लीं LH1 रिंग च इक साफ अंतराल पैदा होंदा ऐ (चित्र 1, ए ते ई) दो αβ हेटरोडाइमरें दी कमी दे कारण, चार बीसीएचएल ते दो कैरोटीनॉइड्स दे नुकसान दे कन्नै, कैरोटीनॉइड्स च कोई बी मुड़ियै αβ-1 सब-यूनिट कन्नै नेईं जुड़दा, जिसदे फलस्वरूप 13 कैरोटीनॉइड शाकाहारी ते 28 बीसीएचएल होंदे न। αβ1 थमां 7 क्षेत्रें च दो परिसरें दे स्थानीय रिजोल्यूशन अनुमान LH1 लूप दे बाकी हिस्सें दी तुलना च घट्ट न, जेह् ड़े आरसी क्यूबी साइट कन्नै लगदे LH1 उप-इकाई दी निहित प्लास्टिकता गी दर्शांदे न (चित्र 4)
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (ए ते बी) ते आरसी-एलएच116 (सी ते डी) दी तस्वीरें गी इक गै शीर्शक दृश्य/साइड व्यू (ए ते बी) (ए ते सी) ते चित्र 1. (बी ते डी) दी गुहा सतह थमां दस्सेआ गेआ ऐ। रंगीन कुंजियां दाएं पास्से दस्सी गेदियां न।
1:14 दे स्टोइकियोमेट्रिक अनुपात कन्नै इकमात्र होर विशेषता कोर परिसर रोडोकोकस स्फेरोइड्स (Rba.) आरसी-एलएच1-पफएक्स डाइमर (13) ऐ। हालांकि, प्रोटीन डब्ल्यू ते पफएक्स दा कोई स्पष्ट समरूपता नेईं ऐ, ते उंदी अपनी-अपनी एलएच 1 संरचनाएं पर मता असर पौंदा ऐ। PufX इक एन-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक डोमेन कन्नै इकल टीएमएच ऐ जेह् ड़ा आरपीएस दे अनुरूप स्थिति च आरसी-एच सब-यूनिट (13) दे साइटोप्लाज्मिक पक्ष कन्नै परस्पर क्रिया करदा ऐ। पलुस्ट्रिस एल एच 116αβ-16। PufX आरसी-एलएच1 ते साइटोक्रोम बीसीएल परिसर दे बश्कार क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज आस्तै इक चैनल बनांदा ऐ ते सारे आरबीए च मौजूद ऐ। स्फेरोइड्स कोर परिसर (13)। हालांकि मोनोमर-मोनोमर इंटरफेस आरबीए च ऐ। स्फेरोइड्स आरसी-एलएच1-पफएक्स डाइमर आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च प्रोटीन डब्ल्यू दी बद्धोबद्ध स्थिति च स्थित ऐ, ते पफएक्स ते प्रोटीन-डब्ल्यू द्वारा प्रेरित अंतराल इक समतुल्य स्थिति च ऐ (चित्र S7A)। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च गैप स्यूडोमोनास रोसिया एलएच1 दे काल्पनिक क्विनोन चैनल (8) कन्नै बी संरेखित ऐ, जेह्ड़ा प्रोटीन डब्ल्यू जां पफएक्स कन्नै सरबंधत नेईं पेप्टाइड्स कन्नै बने दा ऐ (चित्र S7B)। इसदे अलावा, बीएलसी च क्विनोन चैनल। इक γ सब-यूनिट (7) गी छोड़ियै बने दा पन्ना हरे रंग दा LH1 इसी जनेही स्थिति च स्थित ऐ (चित्र S7C)। हालांकि बक्ख-बक्ख प्रोटीनें दे माध्यम कन्नै, आरसी-एलएच1 परिसर च इक आम स्थिति च इनें क्विनोन/क्विनोलोल चैनलें दा प्रकट होना अभिसरण विकास दा इक उदाहरण लगदा ऐ, जेह्ड़ा इस गल्लै गी दस्सा करदा ऐ जे प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा पैदा कीता गेदा अंतर क्विनोन चैनल दे रूप च कम्म करी सकदा ऐ।
LH114-W लूप च अंतराल प्रोटीन च जि’यां प्रोटीन दे छिद्र दे माध्यम कन्नै दो डोमेन गी जोड़ने दे बजाय, आरसी-LH114-W परिसर दी अंदरूनी जगह ते बल्क झिल्ली (चित्र 1G) दे बश्कार इक लगातार झिल्ली क्षेत्र दे निर्माण दी अनुमति दिंदा ऐ। आरसी-एलएच116 परिसर इक बंद Tch दे समान ऐ। सुई-जैसा परिसर (22) (चित्र 1 एच)। चूंकि झिल्ली दे माध्यम कन्नै क्विनोन दा प्रसार संकीर्ण प्रोटीन चैनल दे माध्यम कन्नै प्रसार थमां तेज होंदा ऐ, इस करियै खुल्ला LH114-W लूप बंद LH116 लूप थमां तेज़ आरसी टर्नओवर दी अनुमति देई सकदा ऐ, ते आरसी च क्विनोन दा प्रसार मता सीमित होई सकदा ऐ। एह् परीक्षण करने आस्तै जे प्रोटीन डब्ल्यू आरसी दे माध्यम कन्नै क्विनोन दे रूपांतरण गी प्रभावित करदा ऐ जां नेईं, असें यूबिक्विनोन 2 (UQ2) (कुदरती UQ10 दा इक एनालॉग जिस च इक छोटी आइसोप्रीन पूंछ ऐ) दी इक निश्चित सांद्रता पर साइटोक्रोम ऑक्सीकरण परीक्षण कीता (चित्र 2E)। हालांकि किलेटेड क्विनोन दी मौजूदगी प्रगट माइकेलिस स्थिरांक (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू ते आरसी-एलएच116 क्रमशः 0.2±0.1μM ते 0.5±0.2μM आस्तै उपयुक्त न) दे सटीक निर्धारण च बाधा करदी ऐ, पर आरसी-एलएच114-डब्ल्यू ( 4.6±0.2 ई-आरसी-1 एस-1) दी मती दर ऐ आरसी-एलएच116 (3.6±0.1 ई-आरसी-1 एस-1) थमां 28±5% बड्डा।
अस शुरू च अनुमान लाया हा जे प्रोटीन-डब्ल्यू कोर परिसर दे लगभग 10% च मौजूद ऐ ( 16 ); इत्थै, घट्ट रोशनी, मध्यम प्रकाश, ते उच्च प्रकाश विकास कोशिकाएं दी कब्जे दी दर क्रमशः 15±0.6%, 11±1% ते 0.9±0.5 ऐ (चित्र 2F) । मास स्पेक्ट्रोमेट्री दी मात्रात्मक तुलना कन्नै पता चलेआ जे हिस्टिडीन टैग दे जोड़े जाने कन्नै जंगली किस्म दे उपभेदें (P = 0.59) दी तुलना च प्रोटीन-डब्ल्यू दी सापेक्ष प्रचुरता च कमी नेईं आई, इस करी एह् स्तर संशोधित प्रोटीन-डब्ल्यू दा आर्टिफैक्ट नेईं न (चित्र S10)। लेकन आरसी-एलएच1 परिसर च प्रोटीन-डब्ल्यू दी एह् घट्ट कब्जा किश आरसी गी तेजी कन्नै फ्लिप करने दी अनुमति देई सकदी ऐ, जिस कन्नै आरसी-एलएच116 परिसर च धीमी गति कन्नै क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज गी घट्ट कीता जाई सकदा ऐ। असें दिक्खेआ जे उच्च प्रकाश कब्जे दी दर हाल दे ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स डेटा कन्नै असंगत ऐ, जेह् ड़ी इस गल्लै गी दर्शांदी ऐ जे मजबूत रोशनी दे हेठ pufW जीन अभिव्यक्ति च वृद्धि होंदी ऐ (चित्र S11) (23)। आरसी-एलएच 1 परिसर च pufW ट्रांसक्रप्शन ते प्रोटीन-W दे समावेश च अंतर भ्रमित ऐ ते प्रोटीन दे जटिल नियमन गी दर्शांदा ऐ ।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च 6 कार्डियोलिपिन (सीडीएल), 7 फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीओपीसी), 1 फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल (पीओपीजी) ते 29 β-डीडीएम अणुएं गी इस च 6 सीडीएल, 24 पीओपीसी, 2 पीओपीजी ते 12 βडीडीएम आवंटित कीता जंदा ऐ ते मॉडल कीता जंदा ऐ। आरसी-एलएच116 (चित्र 5, ए ते बी)। इनें दऊं संरचनाएं च सीडीएल लगभग परिसर दे साइटोप्लाज्मिक पक्ष च स्थित ऐ , जदके पीओपीसी, पीओपीजी ते β-डीडीएम मते सारे लुमिनल पक्ष च स्थित न। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर दे αβ-1 थमां αβ-6 क्षेत्र च दो लिपिड ते डिटर्जेंट अणुएं गी अलग कीता गेआ (चित्र 5 ए), ते पंज आरसी-एलएच116 दे समतुल्य क्षेत्र च अलग कीते गे (चित्र 5 बी) परिसर दे दुए पास्सै, मुख्य रूप कन्नै सीडीएल, आरसी ते αβ-7 थमां αβ-13 दे बश्कार इकट्ठे कीते गेदे मते लिपिड पाये गे (चित्र 5, ए ते बी)। होर संरचनात्मक रूप कन्नै हल कीते गेदे लिपिड ते डिटर्जेंट LH1 रिंग दे बाहर स्थित न, ते अच्छी तरह कन्नै हल कीते गेदे एसिली श्रृंखलाएं LH1 उप-इकाइयें दे बिच्च फैलदियां न, जिसी अस्थायी रूप कन्नै आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च β-डीडीएम दे रूप च नामित कीता गेआ ऐ, ते आरसी च β-डीडीएम दे रूप च परिभाषित कीता गेआ ऐ β-डीडीएम ते पीओपीसी-एलएच116 दे मिश्रण च। साढ़ी संरचना च किलेटिंग लिपिड ते डिटर्जेंट दी समान स्थिति इस गल्लै गी दर्शांदी ऐ जे एह् शारीरिक रूप कन्नै प्रासंगिक बंड साइट न (चित्र S12A) । Tch च समतुल्य अणुएं दी स्थिति च बी अच्छी स्थिरता होंदी ऐ। कोमल ते त्रव। तनाव 970 आरसी-एलएच1s (चित्र S12, बी थमां ई) (9, 12) ते लिपिड सिर समूह दे हाइड्रोजन-बंड अवशेषें ने अनुक्रम संरेखण च काफी अच्छा संरक्षण दिक्खेआ (चित्र S13), जिस कन्नै एह् संकेत होंदा ऐ जे संरक्षित सीडीएल जेह्ड़ा आरसी (24) कन्नै जुड़दा ऐ, एह् साइट आरसी-एलएच1 परिसर च संरक्षित होई सकदियां न।
(ए ते बी) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (ए) ते आरसी-एलएच116 (बी) पेप्टाइड्स गी कार्टून कन्नै दर्शाया गेआ ऐ, ते रंजक गी छड़ें कन्नै दर्शाया गेआ ऐ, जिस च चित्र 1 च रंग योजना दा उपयोग कीता गेआ ऐ लिपिड गी लाल रंग च दस्सेआ गेआ ऐ, ते डिटर्जेंट गी ग्रे च दस्सेआ गेआ ऐ। आरसी क्यूए ते क्यूबी साइटें कन्नै बद्ध यूक्यू पीला ऐ, जिसलै के अलग-थलग यूक्यू नीला ऐ। (सी ते डी) (ए) ते (बी) दे समान विचार, लिपिड छोड़े गेदे न। (ई थमां जी) आरसी-एलएच116 थमां Q1(E), Q2(F) ते Q3(G) दा बधाया गेदा दृश्य, जिस च साइड चेन ऐ जेह् ड़ी इक-दुए गी प्रभावित करदी ऐ। हाइड्रोजन बंड गी काली डैश रेखाएं दे रूप च दस्सेआ गेआ ऐ।
आरसी-एलएच116 च आरसी क्यूए ते क्यूबी यूक्यू, जेह् ड़े चार्ज पृथक्करण प्रक्रिया च इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण च हिस्सा लैंदे न, दोऐ गै अपने बद्धोबद्ध साइटें च विघटित होंदे न। हालांकि, आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च क्यूबी क्विनोन दा हल नेईं कीता गेआ ऐ ते इसदे बारे च विस्तार कन्नै चर्चा कीती जाग। क्यूए ते क्यूबी क्विनोन दे अलावा, दो किलेटेड यूक्यू अणु (आरसी ते एलएच1 रिंगें दे बिच्च स्थित) गी आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना च उंदे अच्छी तरह कन्नै हल कीते गेदे सिर समूहें (क्रमशः क्यू1 ते क्यू2 च स्थित) दे अनुसार आवंटित कीता जंदा ऐ। थाहर)। चित्रा 5 सी)। दो आइसोप्रीन इकाइयां Q1 गी सौंपे गेदे न, ते घनत्व नक्शा Q2 दे पूरे 10 आइसोप्रीन पूंछें गी हल करदा ऐ। आरसी-एलएच116 दी संरचना च, त्रै किलेटेड यूक्यू10 अणु (क्यू1 थमां क्यू3, चित्रा 5 डी) हल कीते गे हे, ते सारे अणुएं दी पूरी पूंछ च साफ घनत्व होंदा ऐ (चित्र 5, डी थमां जी)। दो संरचनाएं च, Q1 ते Q2 दे क्विनोन सिर समूहें दी स्थिति च उत्कृष्ट स्थिरता ऐ (चित्र S12F), ते एह् सिर्फ आरसी कन्नै गै परस्पर क्रिया करदे न। Q1 आरसी-एलएच114-डब्ल्यू दे डब्ल्यू गैप दे प्रवेश द्वार पर स्थित ऐ (चित्र 1जी ते 5, सी, डी ते ई), ते Q2 क्यूबी बाइंडिंग साइट दे कोल स्थित ऐ (चित्र 5, सी, डी) ते एफ)। संरक्षित एल-Trp143 ते एल-Trp269 अवशेष Q1 ते Q2 दे मते नेड़े न ते संभावित π-स्टैकिंग परस्पर क्रियाएं प्रदान करदे न (चित्र 5, ई ते एफ, ते चित्रा S12)। L-Gln88, Q1 दे डिस्टल ऑक्सीजन थमां 3.0 Å, इक मजबूत हाइड्रोजन बंड प्रदान करदा ऐ (चित्र 5E); एह् अवशेष सारें शा दूर दे रिश्ते गी छोड़ियै सारे आरसी च संरक्षित ऐ (चित्र S13)। L-Ser91 होर मते सारे आरसी च Thr आस्तै रूढ़िवादी रूप कन्नै प्रतिस्थापित ऐ (चित्र S13), Q1 दे मिथाइल आक्सीजन थमां 3.8 एंगस्ट्रॉम ऐ, ते कमजोर हाइड्रोजन बंड प्रदान करी सकदा ऐ (चित्र 5E)। Q3 च कोई खास परस्पर क्रिया नेईं दिक्खी जंदी ऐ, पर आरसी-एम सब-यूनिट ते LH1-α सब-यूनिट 5 थमां 6 दे बश्कार हाइड्रोफोबिक क्षेत्र च स्थित ऐ (चित्र 5, डी ते जी)। Q1, Q2 ते Q3 जां नेड़में किलेटेड क्विनोन गी बी Tch च हल कीता गेआ ऐ। कोमल, त्रव। तनाव 970 ते बीएलसी। परितारिका संरचना (9, 10, 12) आरसी-एलएच1 परिसर च इक संरक्षित सहायक क्विनोन बाइंडिंग साइट दी ओर इशारा करदी ऐ (चित्र S12G)। आरसी-एलएच116 च पंज विघटित यूक्यू उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) कन्नै निर्धारत हर परिसर दे 5.8±0.7 कन्नै खरी चाल्ली सहमत न, जिसलै के आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च त्रै विघटित यूक्यू 6.2±0.3 (चित्र S14) दा मापा मूल्य दर्शांदा ऐ जे संरचना च अनसुलझे यूक्यू अणु न।
छद्म-सममित एल ते एम पॉलीपेप्टाइड च हर इक च पंज टीएमएच होंदे न ते इक हेटरोडाइमर बनांदे न जेह् ड़े इक बीसीएचएल डाइमर, दो बीसीएचएल मोनोमर, दो बैक्टीरियोफेज (बीपीएच) मोनोमर, ते इक गैर-हीम लोहे ते इक जां दो यूक्यू10 अणुएं गी मिलांदे न। टर्मिनल कीटोन समूह पर हाइड्रोजन बंड दी मौजूदगी ते आरपीएस च इसदे ज्ञात संचय दे माध्यम कन्नै कैरोटीनॉइड्स गी एम-सबयूनिट च शामल कीता जंदा ऐ, जिसदा नांऽ सिस-3,4-डीहाइड्रोरोडोपिन ऐ। प्रजाति (25) दा। आरसी-एच दे बाहरी झिल्ली डोमेन गी इक गै टीएमएच द्वारा झिल्ली कन्नै लंगर लाया जंदा ऐ। समग्र आरसी संरचना सरबंधत प्रजातियें (जि’यां आरबीए) दे त्रै उप-इकाई आरसी दे समान ऐ । स्फेरोइड्स (पीडीबी आईडी: 3 आई 4 डी)। बीसीएचएल ते बीपीएच दे मैक्रोसाइकिल, कैरोटीनॉइड रीढ़ ते गैर-हीम लोहे इनें संरचनाएं दी रिजोल्यूशन रेंज दे अंदर ओवरलैप होंदे न, जि’यां क्यूए साइट पर यूक्यू10 हेड समूह ते आरसी-एलएच116 पर क्यूबी क्विनोन (चित्र S15)
बक्ख-बक्ख क्यूबी साइट कब्जे दरें कन्नै दो आरसी संरचनाएं दी उपलब्धता क्यूबी क्विनोन बाइंडिंग कन्नै होने आह् ले लगातार संरचनात्मक बदलावें दी जांच करने दा इक नमां मौका दिंदी ऐ। आरसी-एलएच116 परिसर च, क्यूबी क्विनोन पूरी चाल्लीं बद्ध "प्रोक्सिमल" स्थिति च स्थित ऐ (26), पर आरसी-एलएच114-डब्ल्यू दे बक्ख-बक्ख होने च क्यूबी क्विनोन नेईं ऐ। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू च कोई क्यूबी क्विनोन नेईं ऐ, जेह् ड़ा हैरानी आह् ला ऐ की जे परिसर सक्रिय ऐ, संरचनात्मक रूप कन्नै हल कीते गेदे क्यूबी क्विनोन कन्नै आरसी-एलएच116 परिसर थमां मता। हालांकि दो एलएच 1 रिंग लगभग छह क्विनोन गी किलेट करदे न , पर बंद आरसी-एलएच116 रिंग च पंज संरचनात्मक रूप कन्नै हल होंदे न , जदके खुल्लै आरसी-एलएच114-डब्ल्यू रिंग च सिर्फ त्रै संरचनात्मक रूप कन्नै सीमित न एह् बधाए गेदे संरचनात्मक विकार आरसी-एलएच114-डब्ल्यू क्यूबी साइटें दे तेजी कन्नै बदलने, परिसर च तेज़ क्विनोन गतिकी ते एलएच 1 लूप गी पार करने दी संभावना च वृद्धि गी दर्शांदा होई सकदा ऐ । अस सुझाऽ दिन्दे आं जे आरसी-एलएच114-डब्ल्यू दी आरसी क्यूबी साइट च यूक्यू दी कमी इक होर जटिल ते मते सक्रिय परिसर दा नतीजा होई सकदा ऐ, ते आरसी-एलएच114-डब्ल्यू दी क्यूबी साइट गी यूक्यू टर्नओवर च फौरन जमे दा ऐ विशिष्ट चरण (क्यूबी साइट दा प्रवेश द्वार बंद करी दित्ता गेआ ऐ) इस गतिविधि दी संरचना गी दर्शांदा ऐ।
क्यूबी दे बगैर, एल-फे217 दा साथ-साथ घुमाव इक ऐसी स्थिति च जेह् ड़ी यूक्यू10 बाइंडिंग कन्नै असंगत ऐ, की जे एह् पूंछ दी पैह् ली आइसोप्रीन इकाई कन्नै स्थानिक टक्कर पैदा करग (चित्र 6 ए)। इसदे अलावा, स्पष्ट मुख्य संरचनात्मक बदलाव स्पष्ट न, खास करियै हेलिक्स डी (टीएमएच डी ते ई दे बश्कार लूप च छोटा हेलिक्स) जित्थें एल-Phe217 गी क्यूबी बाइंडिंग जेब ते एल-Tyr223 दे घुमाव च शिफ्ट कीता जंदा ऐ (चित्र 6A ) M-Asp45 ढांचे कन्नै हाइड्रोजन बंड गी तोड़ने ते क्यूबी बाइंडिंग साइट दे प्रवेश द्वार गी बंद करने आस्तै (चित्र 6 बी) दा। हेलिक्स दे अपने आधार पर पिवट होंदा ऐ, L-Ser209 दा Cα 0.33Å शिफ्ट होंदा ऐ, जिसलै के L-Val221Cα 3.52Å शिफ्ट होंदा ऐ। टीएमएच डी ते ई च कोई बी निरीक्षण योग्य बदलाव नेईं ऐ , जेह् ड़े दौनें संरचनाएं च सुपरइम्पोजेबल न (चित्र 6 ए) । जित्थें तकर अस जानने आं, एह् कुदरती आरसी च पैह्ली संरचना ऐ जेह्ड़ी क्यूबी साइट गी बंद करदी ऐ। पूरी (क्यूबी-बाउंड) संरचना कन्नै तुलना कीती जंदी ऐ जे क्विनोन गी घट्ट करने थमां पैह् ले, इसगी क्विनोन च प्रवेश करने आस्तै इक संरचनात्मक बदलाव दी लोड़ होंदी ऐ। L-Phe217 घूमदा ऐ तां जे क्विनोन सिर समूह कन्नै π-स्टैकिंग परस्पर क्रिया बनी सकै, ते हेलिक्स बाहर बक्खी शिफ्ट होई जंदा ऐ, जिस कन्नै एल-Gly222 दे कंकाल ते L-Tyr223 दी साइड चेन गी स्थिर हाइड्रोजन बंड संरचना कन्नै हाइड्रोजन बंड नेटवर्क बनाने दी अनुमति दित्ती जंदी ऐ (चित्र 6, ए ते सी)।
(ए) होलोग्राम (एल श्रृंखला, नारंगी/एम श्रृंखला, मैजेंटा) ते एपो (ग्रे) संरचना दा ओवरलैपिंग कार्टून, जिस च कुंजी अवशेषें गी रॉड-जैसे प्रतिनिधित्व दे रूप च प्रदर्शत कीता जंदा ऐ। UQ10 गी पीले रंग दी पट्टी कन्नै दर्शाया जंदा ऐ। बिंदीदार रेखा पूरी संरचना च बने दे हाइड्रोजन बंड गी दर्शांदी ऐ। (बी ते सी) एपोलिपोप्रोटीन ते पूरी रिंग संरचना दा सतह दा प्रतिनिधित्व, क्रमशः नीले रंग च एल-Phe217 ते लाल रंग च एल-Tyr223 दी साइड चेन ऑक्सीजन गी उजागर करदा ऐ। एल उप-इकाई नारंगी रंग दी ऐ; एम ते एच उप-इकाइयां रंगीन नेईं होंदियां न। (डी ते ई) एपोलिपोप्रोटीन (डी) ते पूरे (ई) आरसी क्यूबी साइटें [क्रमशः (ए) द्वारा रंग] ते थर्मोफिलस थर्मोफिलस पीएसआईआई (प्लास्टिक क्विनोन कन्नै हरा, नीला; पीडीबी आईडी: 3WU2) संरेखित करो (58)।
अप्रत्याशित रूप कन्नै, हालांकि एलएच 1 दे बगैर क्यूबी-कमी आह्ले आरसी दी केईं संरचनाएं उपलब्ध न, पर इस अध्ययन च दिक्खे गेदे संरचना च बदलाव दी जानकारी पैह्लें नेईं दित्ती गेई ऐ । इनें च बीएलसी थमां क्यूबी डिप्लीशन संरचना शामल ऐ। viridis (पीडीबी आईडी: 3पीआरसी) (27), टीसीएच। टेपिडम (पीडीबी आईडी: 1EYS) (28) ते आरबीए। स्फेरोइड्स (पीडीबी आईडी: 1ओजीवी) (29), जेह्ड़े सारे लगभग उंदी समग्र क्यूबी संरचना दे समान न। 3पीआरसी दे नेड़में निरीक्षण कन्नै पता चलेआ जे एलडीएओ (लॉरिल डाइमिथाइल अमीन ऑक्साइड) डिटर्जेंट अणु क्यूबी स्थिति दे प्रवेश द्वार पर बन्नी जंदे न, जेह् ड़े बंद संरचना च पुनर्व्यवस्था गी रोक सकदे न। हालांकि एलडीएओ 1EYS जां 1OGV च इक गै स्थिति च विघटित नेईं होंदा ऐ, पर एह् आरसी इक गै डिटर्जेंट दा इस्तेमाल करियै तैयार कीते जंदे न ते इस करी इक गै प्रभाव पैदा करी सकदे न। आरबीए दी क्रिस्टलीय संरचना। साइटोक्रोम c2 (PDB ID: 1L9B) कन्नै सह-क्रिस्टल कीते गेदे स्फेरोइड्स आरसी च बी बंद क्यूबी साइट दिक्खी जंदी ऐ। हालांकि, इस मामले च, आरसी-एम पॉलीपेप्टाइड दा एन-टर्मिनल क्षेत्र (क्यू हेलिक्स पर Tyr अवशेष दे एच बंड दे माध्यम कन्नै क्यूबी बाइंडिंग साइट कन्नै परस्पर क्रिया करना) इक अप्राकृतिक संरचना अपनांदा ऐ, ते क्यूबी संरचना परिवर्तन दी होर खोज नेईं कीती जंदी ऐ (30) आश्वस्त करने आह् ली गल्ल एह् ऐ जे असें आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना च एम पॉलीपेप्टाइड दी इस चाल्ली दी विरूपता नेईं दिक्खी ऐ, जेह् ड़ी लगभग आरसी-एलएच116 आरसी दे एन-टर्मिनल क्षेत्र दे समान ऐ। एह् बी ध्यान रखना चाहिदा जे डिटर्जेंट आह्ले एलएच 1 एंटीना दे खत्म होने दे बाद पीडीबी च एपोलिपोप्रोटीन आरसी गी हल कीता गेआ हा, जिस कन्नै आरसी ते आसपास दे एलएच 1 रिंग दी अंदरूनी सतह दे बश्कार अंतराल च अंदरूनी क्विनोन पूल ते लिपिड खत्म होई गे (31, 32)। आरसी फ़ंक्शनल रेहंदा ऐ की जे एह् सारे कोफैक्टरें गी बरकरार रखदा ऐ , सिवाय विघटनशील क्यूबी क्विनोन दे , जेह्ड़ा कम स्थिर होंदा ऐ ते अक्सर तैयारी प्रक्रिया दे दौरान खोई जंदा ऐ ( 33 ) । इसदे अलावा, एह् जानने आह् ला ऐ जे आरसी थमां एलएच 1 ते प्राकृतिक चक्रीय लिपिड गी हटाने कन्नै फंक्शनें पर असर पौंदा ऐ, जि’यां चार्ज-अलग पी + क्यूबी-स्टेट दी घट्ट उम्र (31, 34, 35)। इसलेई, अस अनुमान लाने आं जे आरसी दे आसपास दी मकामी एलएच1 रिंग दा अस्तित्व "बंद" क्यूबी साइट गी बनाए रखी सकदा ऐ, जिस कन्नै क्यूबी दे कोल मकामी वातावरण गी संरक्षित कीता जाई सकदा ऐ।
हालांकि एपोलिपोप्रोटीन (क्यूबी क्विनोन दे बगैर) ते पूरी संरचना क्यूबी साइट दे टर्नओवर दे सिर्फ दो स्नैपशॉट दा प्रतिनिधित्व करदी ऐ, पर घटनाएं दी श्रृंखला दे बजाय, इस गल्लै दे संकेत न जे बद्धोबद्ध गी गेट कीता जाई सकदा ऐ तां जे हाइड्रोक्विनोन द्वारा पुनर्बद्ध होने गी रोकने आस्तै सब्सट्रेट निरोध गी रोकने आस्तै। एपोलिपोप्रोटीन दे क्यूबी साइट दे कोल क्विनोलोल ते क्विनोन दी परस्पर क्रिया बक्ख-बक्ख होई सकदी ऐ, जिस कन्नै आरसी द्वारा इसगी खारिज करी दित्ता जंदा ऐ। लंबे समें थमां एह् प्रस्ताव कीता गेआ ऐ जे संरचना च बदलाव क्विनोनें दे बन्नै ते घट्ट होने च भूमिका निभांदे न। जमे दे आरसी दी काले अनुकूलन दे बाद क्विनोन गी घट्ट करने दी क्षमता बिगड़ी जंदी ऐ (36); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी दस्सदा ऐ जे एह् नुकसान क्यूबी क्विनोन गी सक्रिय निकटतम स्थिति थमां लगभग 4.5 Å "डिस्टल" संरचना च फंसे दे कारण होंदा ऐ (26) , 37)। अस सुझाऽ दिन्दे आं जे एह् डिस्टल बद्धोबद्ध संरचना एपोलिपोप्रोटीन ते पूरी रिंग संरचना दे बश्कार बिचौलियें दी स्थिति दा स्नैपशॉट ऐ , जेह्ड़ी क्विनोन कन्नै शुरूआती परस्पर क्रिया ते क्यूबी साइट दे खुलने दे बाद होंदी ऐ
किश फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया ते साइनोबैक्टीरिया, शैल ते पौधें दे पीएसआईआई परिसर च पाया जाने आह् ला टाइप II आरसी च संरचनात्मक ते कार्यात्मक संरक्षण ऐ ( 38 ) । चित्र 6 (डी ते ई) च दिक्खेआ गेआ संरचनात्मक संरेखण पीएसआईआई आरसी ते बैक्टीरिया आरसी परिसर दी क्यूबी साइट दे बश्कार समानता पर जोर दिंदा ऐ। एह् तुलना लंबे समें थमां क्विनोन बंड ते घट्ट करने दे नेड़में कन्नै सरबंधत प्रणाली दा अध्ययन करने आस्तै इक माडल रेही ऐ। पिछले प्रकाशनें च सुझाऽ दित्ता गेआ ऐ जे संरचना च बदलाव दे कन्नै-कन्नै क्विनोन दी पीएसआईआई कमी बी होंदी ऐ ( 39 , 40 ) । इसलेई आरसी दे विकासशील संरक्षण गी दिक्खदे होई एह् पैह् ले थमां गै अनदेखे बद्धोबद्ध तंत्र आक्सीजन आह्ले फोटोट्रोफिक पौधें च पीएसआईआई आरसी दे क्यूबी साइट पर बी लागू होई सकदा ऐ।
Rps ΔpufW (अनलेबल pufW डिलीशन) ते PufW-His (C-टर्मिनल 10x His-टैग प्रोटीन-W प्राकृतिक pufW लोकस थमां व्यक्त कीता गेआ) उपभेदें। palustris CGA009 दा वर्णन साढ़े पिछले कम्मै च कीता गेआ हा (16)। इनें उपभेदें ते आइसोजेनिक जंगली किस्म दे माता-पिता गी फ्रीजर थमां पीवाईई (हर 5 ग्राम लीटर -1) (-80 डिग्री सेल्सियस पर एलबी च संग्रहीत, जिस च 50% ( w/v) ग्लिसरॉल) प्रोटीन, खमीर अर्क ते सुक्सीनेट) अगर [1.5% (w/v)] प्लेट पर थोड़ी संख्या च कोशिकाएं गी स्ट्रीक करियै बरामद कीता गेआ हा। प्लेट गी अवायवीय परिस्थितियें च कमरे दे तापमान पर रातीं दे समें न्हेरे च इन्क्यूब कीता गेआ हा, ते उसदे बाद ओएसआरएएम 116-डब्ल्यू हैलोजन बल्ब (आरएस कंपोनेंट, यूके) आसेआ उपलब्ध करोआए गेदे सफेद रोशनी (~50 μmolm-2 s-1) कन्नै 3 थमां 5 दिनें तगर रोशन कीता गेआ हा, जिसलै तकर इक गै कालोनी नेईं दिक्खी जंदी ही। 0.1% (w/v) कैसामिनो एसिड (इसदे बाद M22) कन्नै पूरक 10 मिलीलीटर M22+ माध्यम (41) गी टीका करने आस्तै इक गै कालोनी दा इस्तेमाल कीता गेआ। संस्कृति गी 34 डिग्री सेल्सियस पर न्हेरे च घट्ट आक्सीजन दी स्थिति च 48 घैंटें तगर 180 आरपीएम पर हिलाने कन्नै उगाया गेआ हा, ते उसदे बाद 70 मिलीलीटर संस्कृति गी उस्सै परिस्थितियें च 24 घैंटे तगर टीका लगाया गेआ हा। 1 मिलीलीटर दी मात्रा आह् ली अर्ध-एरोबिक संस्कृति दा उपयोग 30 मिलीलीटर यूनिवर्सल स्क्रू-टॉप पारदर्शी कांच दी बोतल च 30 मिलीलीटर एम22 माध्यम दा टीकाकरण ते बाँझ चुंबकीय बल कन्नै 48 घैंटें तगर हलचल (~50μmolm-2 s-1) कन्नै विकिरणित कीता जंदा ऐ। फिर 30 मिलीलीटर कल्चर गी उस्सै परिस्थितियें च लगभग 1 लीटर कल्चर कन्नै टीकाकरण कीता गेआ, जिसदा इस्तेमाल इसदे बाद ~200 μmolm-2 s-1 पर रोशन कीते गेदे लगभग 9 लीटर कल्चर गी 72 घैंटें तगर टीकाकरण कीता गेआ। कोशिकाएं गी 7132 आरसीएफ पर 30 मिंटें तगर सेंट्रीफ्यूज करियै इकट्ठा कीता गेआ, ~10 मिलीलीटर 20 मिमी ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) च फिरी लटकाया गेआ, ते जरूरत पौने तकर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कीता गेआ।
पिघलने दे बाद, पुनर्निलंबित कोशिकाएं च डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस I (मर्क, यूके), लाइसोजाइम (मर्क, यूके) ते दो रोश होलोएंजाइम प्रोटीज इंहिबिटर गोलियां (मर्क, यूके) दे किश क्रिस्टल पाओ। 20,000 पीएसआई फ्रेंच प्रेशर सेल (अमिनको, यूएसए) च कोशिकाएं गी 8 थमां 12 बारी बाधित कीता गेआ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,500 आरसीएफ पर 15 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज करियै अटूट कोशिकाएं ते अघुलनशील मलबे गी हटाने दे बाद, झिल्ली गी 113,000 आरसीएफ पर 2 घैंटें तगर 43,000 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करियै रंजक लाइसेट थमां अवक्षेपित कीता गेआ। घुलनशील अंश गी फेंक देओ ते रंगीन झिल्ली गी 100 थमां 200 मिलीलीटर 20 मिमी ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) च फिरी लटकाओ ते उसलै तकर समरूप बनाओ जिसलै तकर कोई दिक्खने आह्ले इकट्ठे नेईं होन । निलंबित झिल्ली गी 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) च 2% (w/v) β-DDM युक्त 1 घैंटें तगर 4°C पर हल्के ढंगै कन्नै हलचल कन्नै न्हेरे च इन्क्यूब कीता गेआ। फिर 70 डिग्री सेल्सियस पर 150,000 आरसीएफ गी 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घैंटे तगर घोलने आस्तै सेंट्रीफ्यूज करो तां जे अवशिष्ट अघुलनशील पदार्थें गी हटाया जाई सकै।
ΔpufW तनाव थमां घुलनशील झिल्ली गी 50 मिलीलीटर डीईएई सेफारोज आयन एक्सचेंज स्तंभ च बाइंडिंग बफर दे त्रै स्तंभ वॉल्यूम (सीवी) कन्नै [20 मिमी ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) जिस च 0.03% (w / v) β-डीडीएम] लाया गेआ हा। स्तंभ गी दो सीवी बाइंडिंग बफरें कन्नै धोओ, ते फिर स्तंभ गी दो बाइंडिंग बफरें कन्नै धोओ जिंदे च 50 मिमी NaCl होंदा ऐ। आरसी-एलएच116 परिसर गी 1.75 सीवी पर 150 थमां 300 मिमी NaCl (बाइंडिंग बफर च) दे रेखीय ढाल कन्नै इल्यूट कीता गेआ हा, ते बाकी बाइंडिंग परिसर गी 0.5 सीवी पर 300 मिमी NaCl युक्त बाइंडिंग बफर कन्नै इल्यूट कीता गेआ हा। 250 ते 1000 एनएम दे बश्कार अवशोषण स्पेक्ट्रम इकट्ठा करो, अवशोषण अनुपात (A880/A280) गी 880 थमां 280 एनएम पर 1 थमां मता रक्खो, इसगी बाइंडिंग बफर च दो बारी पतला करो, ते शुद्धिकरण पर डीईएई स्तंभ पर इसी प्रक्रिया दा दुबारा इस्तेमाल करो। 1.7 थमां मते A880/A280 अनुपात ते 3.0 थमां मते A880/A805 अनुपात आह् ले अंशें गी पतला करो, आयन एक्सचेंज दा त्रीया दौर करो, ते 2.2 थमां मते A880/A280 अनुपात आह् ले अंशें गी बरकरार रक्खो ते 5.0 थमां मते A880/A805 अनुपात आह् ले अंशें गी बरकरार रक्खो। आंशिक रूप कन्नै शुद्ध परिसर गी एमिकॉन 100,000 आणविक भार कट-ऑफ (MWCO) केन्द्रापसारक फिल्टर (Merck, UK) च ~2 मिलीलीटर तगर केंद्रत कीता गेआ, ते 200 mM NaCl बफर युक्त सुपरडेक्स 200 16/600 आकार बहिष्कार स्तंभ (जीई हेल्थकेयर, यूएस) पर लोड कीता गेआ, ते उसदे बाद इसी बफर च 1.5 CV पर इल्यूट कीता गेआ। आकार बहिष्कार अंश दे अवशोषण स्पेक्ट्रा इकट्ठा करो, ते अवशोषण स्पेक्ट्रा गी 2.4 थमां A880/A280 अनुपात कन्नै ते 5.8 थमां 100 A880 थमां A880/A805 अनुपात कन्नै केंद्रत करो, ते तुरत क्रायो-टीईएम ग्रिड तैयार करने जां भंडारण आस्तै उंदा इस्तेमाल करो जरूरत पौने तगर -80°C पर रक्खो।
PufW-His तनाऽ थमां घुलनशील झिल्ली गी IMAC बफर ( GE Healthcare) च 20 मिलीलीटर HisPrep FF Ni-NTA Sepharose स्तंभ (20 mM tris-HCl (pH 8.0) जिस च 200 mM NaCl ते 0.03% (w/w)) च लाया गेआ हा। v) β-डीडीएम] ऐ। स्तंभ गी आईएमएसी बफर दे पंज सीवी कन्नै धोया गेआ, ते फिर आईएमएसी बफर दे पंज सीवी कन्नै धोया गेआ जेह्दे च 10 मिमी हिस्टिडीन हा। कोर परिसर गी स्तंभ थमां पंज आईएमएसी बफरें कन्नै इल्यूट कीता गेआ हा जिंदे च 100 मिमी हिस्टिडीन हा। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर च होने आह् ले अंश गी एमिकॉन 100,000 मेगावाट फ़िल्टर (मर्क, यूके) कन्नै लैस हलचल टैंक च ~10 मिलीलीटर तगर केंद्रत कीता जंदा ऐ, बाइंडिंग बफर कन्नै 20 बारी पतला कीता जंदा ऐ, ते फिर 25 मिलीलीटर तगर जोड़ेआ जंदा ऐ डीईएई सेफारोज स्तंभ च बफर कन्नै बद्ध चार सीवी दा पैह् ले थमां गै इस्तेमाल कीता जंदा ऐ। स्तंभ गी चार सीवी बद्धोबद्ध बफरें कन्नै धोओ, फिर 0 थमां 100 मिमी NaCl (बाइंडिंग बफर च) दे रेखीय ढाल पर अट्ठ सीवी पर परिसर गी इल्यूट करो, ते बाकी चार सीवी च 100 मिमी बाइंडिंग बफर 2.4 थमां मते A880/A280 अनुपात कन्नै मिलियै सोडियम क्लोराइड पर इल्यूट कीते गेदे अवशिष्ट परिसरें ते... 4.6 अंशें शा मते A880/A805 अनुपात गी एमिकॉन 100,000 मेगावाट केन्द्रापसारक फिल्टर च ~2 मिलीलीटर तगर केंद्रित कीता गेआ हा, ते पैह् ले थमां गै 1.5 सीवी आईएमएसी कन्नै भरेआ गेआ हा बफर संतुलित सुपरडेक्स 200 16/600 आकार बहिष्कार स्तंभ च, ते उसदे बाद 1.5 सीवी पर इसी बफर च इल्यूट कीता गेआ हा। आकार-बहिष्कार अंशें दे अवशोषण स्पेक्ट्रा इकट्ठा करो ते अवशोषण स्पेक्ट्रा गी 2.1 थमां A880/A280 अनुपात ते 4.6 थमां 100 A880 थमां A880/A805 अनुपात कन्नै केंद्रत करो, जेह् ड़े फौरन जमे दे TEM ग्रिड तैयार करने आस्तै इस्तेमाल कीते जंदे न जां जरूरत होने तकर -80°C पर संग्रहीत कीते जंदे न।
कम तापमान आह् ले टीईएम ग्रिड तैयार करने लेई लीका ईएम जीपी विसर्जन फ्रीजर दा इस्तेमाल कीता गेआ। परिसर गी आईएमएसी बफर च 50 दे A880 तगर पतला कीता गेआ, ते उसदे बाद 5μl गी नमें ग्लो-डिस्चार्ज QUANTIFOIL 1.2/1.3 कार्बन-लेपित तांबे दी जाली (Agar Scientific, UK) पर लोड कीता गेआ। ग्रिड गी 20 डिग्री सेल्सियस ते 60% सापेक्ष आर्द्रता पर 30 s तगर इन्क्यूब करो, फिर इसगी 3 s तगर सुक्की लैओ, ते फिर इसगी -176°C पर तरल ईथेन च बुझाओ।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर दे डेटा गी ईबीआईसी (इलेक्ट्रॉनिक बायोइमेजिंग सेंटर) (ब्रिटिश डायमंड लाइट सोर्स) पर टाइटन क्रिओस माइक्रोस्कोप कन्नै रिकार्ड कीता गेआ हा, जेह् ड़ा 300 केवी दे त्वरित वोल्टेज पर कम्म करदा ऐ, जिस च 130,000× दी नाममात्र आवर्धन ते ऊर्जा- 20 ईवी दा अंतर चुनो। डेटा इकट्ठा करने लेई गिनती मोड च छवियां रिकार्ड करने लेई के2 पीक डिटेक्टर कन्नै गैटन 968 जीआईएफ क्वांटम दा इस्तेमाल कीता गेआ। कैलिब्रेटेड पिक्सेल आकार 1.048Å ऐ, ते खुराक दर 3.83 ई-Å-2s-1 ऐ। 11 सेकंड च फिल्म इकट्ठी कीती ते 40 हिस्सें च बंडी। माइक्रोस्कोप गी फिरी फोकस करने आस्तै कार्बन-लेपित इलाके दा इस्तेमाल करो, ते फिर हर छेद च त्रै फिल्में गी इकट्ठा करो। कुल 3130 फिल्में इकट्ठी कीतियां गेइयां, जिंदे च डिफोकस वैल्यू -1 ते -3μm दे बश्कार हे।
आरसी-एलएच116 परिसर आस्तै आंकड़े एस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर लैबोरेटरी (यूनिवर्सिटी ऑफ लीड्स, यूके) च इसी माइक्रोस्कोप दा उपयोग करियै इकट्ठा कीता गेआ। डेटा गी 130 के आवर्धन कन्नै गिनती मोड च इकट्ठा कीता गेआ हा, ते पिक्सेल आकार गी 4.6 ई-Å-2s-1 दी खुराक कन्नै 1.065 Å तगर कैलिब्रेट कीता गेआ हा। फिल्म 12 सेकंड च रिकार्ड कीती गेई ते 48 हिस्सें च बंडी गेई। कुल 3359 फिल्में इकट्ठी कीतियां गेइयां, जिंदे च डिफोकस मान -1 ते -3μm दे बश्कार हे।
सारे डाटा प्रोसेसिंग रिलियन 3.0 पाइपलाइन (42) च कीती जंदी ऐ। खुराक भार कन्नै बीम गति गी ठीक करने आस्तै मोशनकोर 2 (43) दा उपयोग करो, ते फिर सीटीएफ (कंट्रास्ट ट्रांसफर फंक्शन) पैरामीटर निर्धारत करने आस्तै सीटीएफएफआईएनडी 4.1 (44) दा इस्तेमाल करो। इनें शुरुआती प्रसंस्करण चरणें दे बाद ठेठ फोटोमाइक्रोग्राफ गी चित्र 2. S16 च दिक्खेआ गेआ ऐ। स्वचालित चयन टेम्पलेट 250 पिक्सेल फ्रेम च 1000 कणें दे लगभग 250 पिक्सेल गी मैन्युअल रूप कन्नै चुनने ते कोई संदर्भ दो-आयामी (2D) वर्गीकरण नेईं करियै पैदा कीता जंदा ऐ, जिस कन्नै उनें वर्गीकरणें गी नकार दित्ता जंदा ऐ जेह् ड़े नमूनें दे संदूषण गी पूरा करदे न जां जिंदे च कोई बी भेद करने आह् ली विशेषताएं न। फिर, सारे माइक्रोफोटोग्राफें पर स्वचालित चयन कीता गेआ, ते आरसी-एलएच114-डब्ल्यू 849,359 कण हे, ते आरसी-एलएच116 परिसर 476,547 कण हे। सारे चयनित कणें गी गैर-संदर्भ 2D वर्गीकरण दे दो दौर थमां गुजरे दे न, ते हर रन दे बाद, कार्बन क्षेत्र कन्नै मिलने आह् ले कणें, नमूने दे संदूषण, कोई स्पष्ट विशेषता नेईं जां मजबूती कन्नै ओवरलैपिंग कणें गी खारिज करी दित्ता जंदा ऐ, जिसदे फलस्वरूप 772,033 (90.9%) ते 359,678 (75.5%) ) कणें दा इस्तेमाल 3D वर्गीकरण लेई कीता जंदा ऐ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू ते आरसी-एलएच116 क्रमशः। शुरुआती 3D संदर्भ मॉडल गी स्टोचैस्टिक ढाल वंश विधि दा उपयोग करियै पैदा कीता गेआ हा। शुरुआती माडल गी संदर्भ दे रूप च इस्तेमाल करियै चुने गेदे कणें गी 3D च चार श्रेणियें च वर्गीकृत कीता जंदा ऐ। इस श्रेणी च मॉडल दा संदर्भ दे रूप च इस्तेमाल करदे होई, बड्डी श्रेणी दे कणें पर 3D रिफाइनिग करो, फिर विलायक क्षेत्र गी कवर करने आस्तै शुरूआती 15Å लो-पास फिल्टर दा उपयोग करो, 6 पिक्सेल नरम किनारे जोड़ो, ते पिक्सेल गी पोस्ट-प्रोसेस करो तां जे शीर्शक डिटेक्टर दे गैटन के2 पीक मॉड्यूलेशन ट्रांसफर फंक्शन गी ठीक कीता जाई सकै। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू डाटासेट आस्तै, इस शुरूआती मॉडल गी मास्क दे किनारे पर मजबूत घनत्व (यूसीएसएफ काइमेरा च कोर जटिल घनत्व थमां डिस्कनेक्ट) गी हटाइयै संशोधित कीता गेआ हा। नतीजे च माडल (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू ते आरसी-एलएच116 दे रिजोल्यूशन क्रमशः 3.91 ते 4.16 ए ऐ) गी 3 डी वर्गीकरण दे दुए दौर आस्तै संदर्भ दे रूप च इस्तेमाल कीता जंदा ऐ। इस्तेमाल कीते गेदे कणें गी शुरूआती 3D वर्ग च समूहीकृत कीता जंदा ऐ ते इस च मुहल्ले कन्नै मजबूत सहसंबंध नेईं होंदा ऐ। ओवरलैप जां स्पष्ट संरचनात्मक विशेषताएं दी कमी। 3D वर्गीकरण दे दुए दौर दे बाद, उच्चतम रिजोल्यूशन आह् ली श्रेणी दा चयन कीता गेआ [आरसी-एलएच114-डब्ल्यू आस्तै, इक श्रेणी 377,703 कण (44.5%) ऐ, आरसी-एलएच116 आस्तै, दो श्रेणियां न, कुल 260,752 कण (54.7%) , जित्थें एह् सिर्फ इक गै होंदे न जदूं शुरूआती घुमाव दे बाद इक छोटे अंतर कन्नै संरेखित होंदे न चयनित कणें गी 400 पिक्सेल दे डिब्बे च दुबारा कड्ढेआ जंदा ऐ ते 3D रिफाइनिग कन्नै परिष्कृत कीता जंदा ऐ। विलायक मास्क गी शुरूआती 15Å लो-पास फिल्टर, 3 पिक्सेल मैप विस्तार ते 3 पिक्सेल सॉफ्ट मास्क दा उपयोग करियै पैदा कीता जंदा ऐ। प्रति-कण सीटीएफ परिष्कार, प्रति-कण गति सुधार ते प्रति-कण सीटीएफ परिष्कार दे दुए दौर दा उपयोग करदे होई हर कदम दे बाद 3 डी परिष्कार, विलायक मास्किंग ते पोस्ट-प्रोसेसिंग कीती जंदी ऐ तां जे नतीजे च बनावट गी होर परिष्कृत कीता जाई सकै। 0.143 दे एफएससी (फूरियर शेल सहसंबंध गुणांक) कट-ऑफ मूल्य दा उपयोग करदे होई आरसी-एलएच114-डब्ल्यू ते आरसी-एलएच116 दे अंतिम मॉडल दे रिजोल्यूशन क्रमशः 2.65 ते 2.80Å न। अंतिम माडल दी एफएससी वक्र गी चित्र 2. S17 च दस्सेआ गेआ ऐ।
सारे प्रोटीन अनुक्रम UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5) थमां डाउनलोड कीते जंदे न; एलएच 1-α (पुफए; यूनिप्रोटआईडी: क्यू 6 एन 9 एल 4); आरसी-एल (PufL; यूनिप्रोट आईडी: ओ83005); आरसी-एम (PufM; यूनिप्रोट आईडी: ए 0 ए 4 जेड 7); आरसी-एच (पुहए; यूनिप्रोट आईडी: ए 0 ए 4 जेड 9); प्रोटीन-डब्ल्यू (PufW; UniProt आईडी: Q6N1K3)। आरसी दा इक होमोलॉजी मॉडल बनाने लेई स्विस-मॉडल (45) दा इस्तेमाल कीता गेआ, जिस च आरसी-एल, आरसी-एम ते आरसी-एच दे प्रोटीन अनुक्रम ते आरबीए दी क्रिस्टलीय संरचना शामल ऐ। sphaeroides आरसी गी टेम्पलेट (पीडीबी आईडी: 5एलएसई) (46) दे रूप च इस्तेमाल कीता गेआ। जनरेट कीते गेदे मॉडल गी नक्शे (47) च फिट करने आस्तै यूसीएसएफ काइमेरा च "फिट मैप" उपकरण दा उपयोग करो, प्रोटीन संरचना च सुधार करो, ते कोफैक्टर [4×BChl a (मोनोमर लाइब्रेरी अवशेष दा नांऽ = बीसीएल), 2×BPh a (BPH), इक जां दो किस्म दे UQ10 (U10), इक गैर-हीम लोहा (Fe) ते इक 3,4-डाइहाइड्रोहेक्साकार्बोनिल्कोलाइन (QAK)] जोड़ने लेई कूट (48) दा इस्तेमाल करो। चूंकि QAK मोनोमर लाइब्रेरी च उपलब्ध नेईं ऐ, इस करियै इसगी PHENIX (49) च eLBOW टूल दा उपयोग करियै पैरामीटराइज कीता गेआ हा।
अगले, एलएच 1 सबयूनिट दा निर्माण कीता गेआ। शुरू च, PHENIX (49) च स्वचालित निर्माण उपकरण दा इस्तेमाल नक्शे ते LH1-α ते LH1-β प्रोटीन अनुक्रमें गी इनपुट दे रूप च इस्तेमाल करियै LH1 अनुक्रम दे हिस्से दा स्वचालित रूप कन्नै निर्माण करने लेई कीता गेआ। सबनें शा पूरी एलएच 1 सब-यूनिट गी चुनो, इसगी कड्ढो ते कूट च लोड करो, मैन्युअल रूप कन्नै इस च लापता अनुक्रम गी जोड़ो, ते दो बीसीएल ए (बीसीएल) ते इक स्पिरिलोक्सैन्थिन (सीआरटी) गी जोड़ने थमां पैह् ले मैन्युअल रूप कन्नै पूरी संरचना गी परिष्कृत करो [सम्बंधत आरपीएस दे अनुसार एलएच 1 परिसर दा घनत्व ते ज्ञात कैरोटीनॉयड सामग्री। प्रजाति (17)] दा। पूरी LH1 सब-यूनिट दी नकल करो, ते LH1 घनत्व दे बगल दे गैर-माडल क्षेत्र च डॉक करने लेई यूसीएसएफ काइमेरा "डॉकिंग मैप टूल" दा उपयोग करो, ते फिर इसगी कूट च परिष्कृत करो; इस प्रक्रिया गी उसलै तकर दोहराओ जिसलै तकर सारे एलएच 1 उप-इकाइयें दा माडल नेईं कीता जंदा। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना आस्तै, कूट च गैर-आवंटित घनत्व गी कड्ढियै, प्रोटीन गी यूएससीएफ काइमेरा नक्शे च बाकी गैर-प्रोटीन घटकें थमां विभाजित कीता जंदा ऐ ते ऑटोबिल्ड उपकरण दा इस्तेमाल शुरूआती मॉडल गी स्थापित करने लेई कीता जंदा ऐ, ते बाकी उप-इकाइयें (प्रोटीन-डब्ल्यू) मॉडलिंग। फीनिक्स (49) च। कूट (48) च नतीजे दे मॉडल च कुसै बी लापता अनुक्रम गी जोड़ो, ते फ्ही मैन्युअल रूप कन्नै पूरी सब-यूनिट गी परिष्कृत करो। बाकी गैर-आवंटित घनत्व लिपिड (सीडीएल = सीडीएल, पीओपीसी = 6पीएल ते पीओपीजी = पीजीटी), β-डीडीएम डिटर्जेंट (एलएमटी) ते यूक्यू10 अणुएं (यू10) दे संयोजन कन्नै फिट बैठदा ऐ। पूरा शुरूआती मॉडल गी सिद्ध करने आस्तै कूट (48) च PHENIX अनुकूलन (49) ते मैन्युअल अनुकूलन दा उपयोग करो, जदूं तकर जे माडल आंकड़े ते फिट दी दृश्य गुणवत्ता च होर सुधार नेईं कीता जाई सकदा। आखरी च, लोकल नक्शे गी तेज करने आस्तै LocScale (50) दा उपयोग करो, ते फ्ही गैर-आवंटित घनत्व ते स्वचालित ते मैन्युअल अनुकूलन दे मॉडलिंग दे केईं होर चक्रें गी पूरा करो।
अपने-अपने घनत्व दे अंदर डॉक कीते गेदे सरबंधत पेप्टाइड, कोफैक्टर ते होर लिपिड ते क्विनोन गी चित्र 1 ते 2 च दिक्खेआ गेआ ऐ।S18 थमां S23। अंतिम माडल दी सांख्यिक जानकारी तालिका S1 च दित्ती गेई ऐ।
जदूं तकर एह् नेईं दस्सेआ गेआ ऐ, तां यूवी/विस/एनआईआर अवशोषण स्पेक्ट्रा गी कैरी60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एजिलेंट, यूएसए) पर 250 एनएम थमां 1000 एनएम तगर 1 एनएम अंतराल ते 0.1s दे इकीकरण समें पर इकट्ठा कीता गेआ।
नमूने गी क्वार्ट्ज क्यूवेट च 1 दे A880 तगर 2 मिमी मार्ग कन्नै पतला करो, ते 400 ते 1000 एनएम दे बश्कार अवशोषण स्पेक्ट्रम इकट्ठा करो। गोलाकार डाइक्रोइक स्पेक्ट्रा गी जास्को 810 स्पेक्ट्रोपोलारिमीटर (जास्को, जापान) पर 400 एनएम ते 950 एनएम दे बश्कार 1 एनएम अंतराल पर 20 एनएम मिंट-1 दी स्कैन दर कन्नै इकट्ठा कीता गेआ।
मोलर विलुप्त होने दा गुणांक कोर परिसर गी लगभग 50 दे A880 च पतला करियै निर्धारत कीता जंदा ऐ हर मेथनॉल नमूने दी बीसीएचएल सामग्री दी गणना 54.8 मिमी-1 सेमी-1 दे 771 एनएम पर विलुप्त होने दे गुणांक कन्नै कीती गेई ही, ते विलुप्त होने दा गुणांक निर्धारत कीता गेआ हा ( 51 )। कोर जटिल सांद्रता गी निर्धारत करने आस्तै मापे गेदे BChl सांद्रता गी 32 (RC-LH114-W) जां 36 (RC-LH116) कन्नै विभाजित करो, जिसदे बाद बफर विलुप्त होने दे गुणांक च इकट्ठे कीते गेदे उस्सै नमूने दे अवशोषण स्पेक्ट्रम गी निर्धारत करने लेई इस्तेमाल कीता जंदा ऐ। कन्नै-कन्नै। हर नमूने आस्तै त्रै बार-बार माप कीते गे, ते गणना आस्तै बीसीएचएल क्यूवाई अधिकतम दी औसत अवशोषण दा इस्तेमाल कीता गेआ। 878 एनएम पर मापे गेदे आरसी-एलएच114-डब्ल्यू दा विलुप्त होने दा गुणांक 3280±140 मिमी-1 सेमी-1 ऐ, जिसलै के 880 एनएम पर मापे गेदे आरसी-एलएच116 दा विलुप्त होने दा गुणांक 3800±30 मिमी-1 सेमी-1 ऐ।
UQ10 दी मात्रा (52) च दित्ती गेदी विधि दे अनुसार कीती गेई। संक्षेप च, रिवर्स फेज एचपीएलसी (आरपी-एचपीएलसी) गी एजिलेंट 1200 एचपीएलसी प्रणाली दा उपयोग करियै कीता गेआ। 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराइड युक्त 50:50 मेथानॉल:क्लोरोफॉर्म च लगभग 0.02 एनएमओएल आरसी-एलएच116 जां आरसी-एलएच114-डब्ल्यू गी 50μl च घोलना, ते पूर्व-संतुलित बेकमैन कल्टर अल्ट्रास्फीयर ओडीएस 4.6 मिमी एचपीएलसी च 40 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर-1 मिंट-1 च घोलना विलायक (80:20 मेथनॉल: 2-प्रोपानोल) इक × 25 सेमी स्तंभ पर। 275 एनएम (UQ10), 450 एनएम (कैरोटीनॉयड) ते 780 एनएम (BChl) पर 1 घैंटे तगर अवशोषण दी निगरानी आस्तै एचपीएलसी विलायक च आइसोक्रेटिक इल्यूशन करो। 25.5 मिनट च 275 एनएम क्रोमैटोग्राम च चोटी गी इकट्ठा कीता गेआ हा, जिस च कोई होर पता लाने आह् ले यौगिक नेईं हे। समेकित क्षेत्र दा उपयोग 0 थमां 5.8 एनएमओएल दे शुद्ध मानकें दे इंजेक्शन थमां गणना कीते गेदे कैलिब्रेशन वक्र दे संदर्भ च कड्ढे गेदे UQ10 दी मोलर मात्रा दी गणना करने लेई कीता जंदा ऐ (चित्र S14)। हर नमूने दा विश्लेषण त्रै प्रतिलिपिएं च कीता गेआ हा, ते रिपोर्ट कीती गेदी त्रुटि औसत दे एसडी कन्नै मेल खंदा ऐ।
0.1 दी ज़्यादातर Qy अवशोषण आह् ला आरसी-एलएच1 परिसर गी 30 μM घट्ट कीते गेदे घोड़े दे दिल दे साइटोक्रोम c2 (मर्क, यूके) ते 0 थमां 50 μMUQ2 (मर्क, यूके) कन्नै तैयार कीता गेआ। हर UQ2 सांद्रता च त्रै 1-एमएल नमूने तैयार कीते गे ते मापने शा पैह्ले न्हेरे च पूरी चाल्लीं अनुकूलन सुनिश्चित करने आस्तै 4 डिग्री सेल्सियस पर रातीं दे समें न्हेरे च इन्क्यूब कीता गेआ। घोल गी 300 एनएम लौ/500 लाइन ग्रेटिंग, 1.24 मिमी इनलेट, 0.12 मिमी बिचले ते 0.6 मिमी आउटलेट स्लिट कन्नै लैस ओलिस आरएसएम1000 मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर च ​​लोड कीता गेआ। उत्तेजना प्रकाश गी बाहर कड्ढने आस्तै नमूने फोटोट्यूब ते संदर्भ फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब दे प्रवेश द्वार पर 600 एनएम लंबा पास फिल्टर रक्खेआ जंदा ऐ। अवशोषण दी निगरानी 550 एनएम पर 0.15 एस दे इकीकरण समें कन्नै कीती गेई। उत्तेजना प्रकाश 880 एनएम M880F2 एलईडी (लाइट इमिटिंग डायोड) (थॉरलैब्स लिमिटेड, यूके) थमां फाइबर ऑप्टिक केबल दे माध्यम कन्नै डीसी2200 नियंत्रक (थॉरलैब्स लिमिटेड, यूके) दे माध्यम कन्नै 90% तीव्रता कन्नै उत्सर्जित होंदा ऐ ते प्रकाश स्रोत च 90° दे कोन पर उत्सर्जित होंदा ऐ। मापने आह् ला बीम आईने दे विपरीत ऐ तां जे कुसै बी चाल्लीं दी रोशनी गी वापस आह्नने आस्तै जेह् ड़ी शुरू च नमूने कन्नै नेईं सोखी गेई ही। 50 एस दी रोशनी थमां 10 एस पैह् ले अवशोषण दी निगरानी करो। फिर न्हेरे च 60 s तगर अवशोषण दी होर निगरानी कीती गेई तां जे एह् आकलन कीता जाई सकै जे किस हद तकर क्विनोलोल अपने आप गै साइटोक्रोम c23 + गी घट्ट करदा ऐ (कच्चे आंकड़ें आस्तै चित्र S8 दिक्खो)।
डेटा गी 0.5 थमां 10 s दे अंदर इक रेखीय प्रारंभिक दर (UQ2 सांद्रता दे आधार उप्पर) फिट करियै ते हर UQ2 सांद्रता पर त्रैनें नमूनें दी दरें दा औसतन करियै संसाधित कीता गेआ हा। संबंधित विलुप्त होने गुणांक कन्नै गणना कीती गेदी आरसी-एलएच1 सांद्रता दा उपयोग दर गी उत्प्रेरक दक्षता च बदलने लेई कीता गेआ, जिसगी ओरिजिन प्रो 2019 (ओरिजिनलैब, यूएसए) च प्लाट कीता गेआ हा, ते प्रगट किमी ते केकैट मूल्यें गी निर्धारत करने आस्तै माइकेलिस-मेन्टेन मॉडल च फिट कीता गेआ हा।
क्षणिक अवशोषण मापने आस्तै, आरसी-एलएच1 नमूने गी 50 मिमी सोडियम एस्कॉर्बेट (मर्क, यूएसए) ते 0.4 मिमी टर्बुटिन (मर्क, यूएसए) युक्त आईएमएसी बफर च ~2μM तगर पतला कीता गेआ। एस्कॉर्बिक एसिड दा इस्तेमाल बलिदान इलेक्ट्रॉन दाता दे रूप च कीता जंदा ऐ, ते टर्ट-ब्यूटाक्लोफेन दा इस्तेमाल क्यूबी इंहिबिटर दे रूप च कीता जंदा ऐ तां जे एह् सुनिश्चित कीता जाई सकै जे मुक्ख आरसी दाता पूरी मापदंड प्रक्रिया च घट्ट होई जा (अर्थात फोटोऑक्सीडाइज नेईं)। लगभग 3 मिलीलीटर नमूने गी 2 मिमी ऑप्टिकल पथ दी लंबाई आह् ले कस्टम घूमने आह् ले कोशिका (लगभग 0.1 मी व्यास च, ​​350 आरपीएम) च जोड़ेआ जंदा ऐ तां जे एह् सुनिश्चित कीता जाई सकै जे लेजर मार्ग च नमूने च उत्तेजना दालें दे बश्कार काले अनुकूलन आस्तै पर्याप्त समां होऐ। Ti: सैफायर लेजर सिस्टम (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, यूएसए) गी प्रवर्धित करने आस्तै ~100-fs लेजर पल्स दा उपयोग करो तां जे नमूने गी 1 किलोहर्ट्ज (एनआईआर आस्तै 20 एनजे जां विस आस्तै 100 एनजे) दी पुनरावृत्ति दर पर 880 एनएम पर उत्तेजित कीता जाई सकै। डेटा इकट्ठा करने थमां पैह् ले नमूने गी लगभग 30 मिनट तगर उत्तेजना प्रकाश च रक्खो। एक्सपोजर कन्नै क्यूए निष्क्रियता पैदा होग (संभवत: क्यूए गी इक जां दो बारी घट्ट करना)। पर कृपया ध्यान देओ जे एह् प्रक्रिया उलटने आह् ली ऐ की जे काले अनुकूलन दी लम्मी अवधि दे बाद आरसी धीरे-धीरे क्यूए गतिविधि च वापस औग। -10 थमां 7000 पीएस दे देरी समें कन्नै क्षणिक स्पेक्ट्रा गी मापने आस्तै हेलियोस स्पेक्ट्रोमीटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम, यूएसए) दा इस्तेमाल कीता गेआ। डेटा सेट गी अनग्रुप करने लेई सरफेस एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम, यूएसए) दा उपयोग करो, फिर मर्ज ते मानकीकरण करो। क्षय कन्नै सरबंधत विभेदक स्पेक्ट्रा हासल करने लेई संयुक् त डेटा सेट दा उपयोग करने आस्तै CarpetView सॉफ्टवेयर पैकेज (लाइट कन्वर्जन लिमिटेड, लिथुआनिया) दा उपयोग करो, जां इक फंक्शन दा उपयोग करो जेह् ड़ा इकल-तरंगदैर्ध्य स्पेक्ट्रल विकास गी ओरिजिन (OriginLab, USA) च फिट करने आस्तै साधन प्रतिक्रिया कन्नै मते सारे घातांकें गी कन्वोल करदा ऐ।
जि’यां केईं दस्सेआ गेआ ऐ (53), आरसी ते परिधीय एलएच2 एंटीना दोनें दी कमी आह् ली एलएच 1 परिसर आह् ली प्रकाश संश्लेषण फिल्म तैयार कीती गेई। झिल्ली गी 20 मिमी ट्राइस (पीएच 8.0) च पतला कीता गेआ ते उसदे बाद 2 मिमी ऑप्टिकल पथ कन्नै क्वार्ट्ज क्यूवेट च लोड कीता गेआ। नमूने गी 540 एनएम पर -10 थमां 7000 पीएस दे देरी समें कन्नै उत्तेजित करने आस्तै 30nJ लेजर पल्स दा इस्तेमाल कीता गेआ। आरपीएस लेई वर्णत तरीके कन्नै डेटा सेट गी प्रोसेस करो। पाल नमूना।
झिल्ली गी 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घैंटें तगर 150,000 आरसीएफ पर सेंट्रीफ्यूजेशन करियै गोली बनाई गेई, ते उसदे बाद 880 एनएम पर इसदी अवशोषण गी 20 मिमी ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) ते 200 मिमी NaCl च फिरी लटकाया गेआ। 4°C पर न्हेरे च 1 घैंटें तगर 2% (w/v) β-DDM च धीरे-धीरे हलचल करियै झिल्ली गी घोलना। नमूने गी 100 मिमी ट्राइएथिल अमोनियम कार्बोनेट (पीएच 8.0) (टीईएबी; मर्क, यूके) च 2.5 मिलीग्राम एमएल-1 (बायो-रैड विश्लेषण) दी प्रोटीन सांद्रता तगर पतला कीता गेआ। होर प्रसंस्करण पैह् ले प्रकाशत विधि (54) थमां कीता गेआ हा, जिस च 50 μg प्रोटीन गी कुल 50 μl TEAB च पतला करने कन्नै शुरू कीता गेआ हा जिस च 1% (w/v) सोडियम लॉरेट (Merck, UK) हा। 60 एस लेई sonication दे बाद, इसगी 30 मिनट लेई 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिमी ट्राइस (2-कार्बोक्जिएथिल) फॉस्फीन (मर्क, यूके) कन्नै कम कीता गेआ। एस-एलकाइलेशन आस्तै नमूने गी 10 मिमी मिथाइल एस-मिथाइलथियोमेथेनसल्फोनेट (मर्क, यूके) कन्नै इनक्यूब करो ते इसगी 200 मिमी आइसोप्रोपानोल स्टॉक घोल थमां कमरे दे तापमान पर 10 मिनट तगर पाओ। प्रोटीओलाइटिक पाचन गी 2 μg ट्राइप्सिन/एन्डोप्रोटीनेज Lys-C मिश्रण (Promega UK) मिलाइयै कीता गेआ ते 37°C पर 3 घैंटें तगर इन्क्यूब कीता गेआ। लौरेट सरफैक्टेंट गी 50 μl एथिल एसीटेट ते 10 μl 10% (v/v) एलसी ग्रेड ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (TFA; थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) गी मिलाइयै 60 एस तगर भंवर करियै कड्ढेआ गेआ। चरण पृथक्करण गी 15,700 आरसीएफ पर 5 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै बढ़ावा दित्ता गेआ। निर्माता दे प्रोटोकॉल दे अनुसार, पेप्टाइड युक्त निचले चरण गी सावधानी कन्नै एस्पिरेट ते नमक मुक्त करने आस्तै सी 18 स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) दा इस्तेमाल कीता गेआ। वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन कन्नै सुक्खने दे बाद नमूने गी 0.5% टीएफए ते 3% एसीटोनिट्राइल च घोल दित्ता गेआ हा, ते 500 एनजी दा विश्लेषण नैनोफ्लो आरपी क्रोमैटोग्राफी कन्नै जुड़े दे मास स्पेक्ट्रोमेट्री कन्नै पैह् ले विस्तार कन्नै दित्ते गेदे सिस्टम पैरामीटर दा उपयोग करियै कीता गेआ हा।
आरपीएस दी खोज करने आस्तै प्रोटीन दी पन्छान ते मात्रा निर्धारण आस्तै MaxQuant v.1.5.3.30 (56) दा उपयोग करो। पलुस्ट्रिस प्रोटीओम डेटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) ऐ। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीओमिक्स डेटा गी डाटासेट पन्छानने आह् ले PXD020402 दे अंतर्गत PRIDE पार्टनर रिपोजिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) दे माध्यम कन्नै प्रोटीओमएक्सचेंज एलायंस च जमा कीता गेआ ऐ।
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री कन्नै जुड़े दे आरपीएलसी द्वारा विश्लेषण आस्तै, आरसी-एलएच1 परिसर जंगली किस्म दे आरपीएस थमां तैयार कीता गेआ। पैह् ले प्रकाशत विधि (16) दा उपयोग करदे होई, पलुस्ट्रिस कोशिकाएं च पैदा कीती गेई प्रोटीन दी सांद्रता 20 मिमी हेपेस (पीएच 7.8), 100 मिमी NaCl ते 0.03% (w/v) β- (बायो-रैड विश्लेषण) ) डीडीएम च 2 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 ही। निर्माता दे प्रोटोकॉल दे अनुसार, बरखा विधि कन्नै 10 μg प्रोटीन गी कड्ढने आस्तै 2D शुद्धिकरण किट (जीई हेल्थकेयर, यूएसए) दा इस्तेमाल करो, ते अवसाद गी 20 μl 60% (v / v) फार्मिक एसिड (FA), 20% (v / v) एसीटोनिट्राइल ते 20% (v/v) पानी च घोलना। पंज माइक्रोलीटर दा विश्लेषण आरपीएलसी (डायोनेक्स आरएसएलसी) कन्नै मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मैक्सिस यूएचआर-टीओएफ, ब्रूकर) कन्नै कीता गेआ। 60°C ते 100μlmin -1 पर अलगाव आस्तै MabPac 1.2×100 मिमी स्तंभ (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) दा उपयोग करो, जिस च 85% (v / v) विलायक A [0.1% (v / v) FA ते 0.02% (V/v) TFA जलीय घोल] थमां 85%(v/v) विलायक बी दे ढाल कन्नै [0.1%(v/v) FA ते 0.02%(v/v) 90%(v/v) एसीटोनिट्राइल TFA च] 60 मिनट थमां मते समें लेई मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत ते डिफ़ॉल्ट पैरामीटर दा उपयोग करदे होई, मास स्पेक्ट्रोमीटर 100 थमां 2750 m/z (मास-टू-चार्ज अनुपात) हासल करदा ऐ। ExPASy बायोइन्फोर्मैटिक्स संसाधन पोर्टल FindPept टूल (https://web.expasy.org/findpept/) दी मदद कन्नै, परिसर दी उप-इकाइयें च मास स्पेक्ट्रम दा नक्शा बनाओ।
कोशिकाएं गी 100 मिलीलीटर एनएफ-कम (10μMm-2 s-1), मध्यम (30μMm-2 s-1) जां उच्च (300μMm-2 s-1) प्रकाश च 72 घैंटें तगर उगाया गेआ। M22 माध्यम (M22 माध्यम जिस च अमोनियम सल्फेट गी छोड़ी दित्ता जंदा ऐ ते सोडियम सुसिनेट गी सोडियम एसीटेट कन्नै बदलेआ जंदा ऐ) 100 मिलीलीटर स्क्रू-टॉप बोतल (23) च। पंज 30-s चक्रें च 0.1 माइक्रोन ग्लास बीड्स गी 1:1 दे आयतन अनुपात च बीड कीता गेआ तां जे कोशिकाएं गी लाइस कीता जाई सकै ते बर्फ पर 5 मिनट तगर ठंडा कीता गेआ। अघुलनशील पदार्थ, अटूट कोशिकाएं ते कांच दे मोती गी बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज च 16,000 आरसीएफ पर 10 मिनट तगर सेंट्रीफ्यूज करियै हटाया गेआ। झिल्ली गी 40/15% (w/w) सुक्रोज ढाल कन्नै 20 mM tris-HCl (pH 8.0) च 100,000 RCF कन्नै Ti 70.1 रोटर च 10 घैंटे तगर बक्ख कीता गेआ।
जि’यां साढ़े पिछले कम्मै च दस्सेआ गेआ ऐ, PufW (16) पर His टैग दा इम्यूनोडिटेक्शन। संक्षेप च, शुद्ध कोर परिसर (11.8 एनएम) जां 2x एसडीएस लोडिंग बफर (मर्क, यूके) च आरसी दी इक गै सांद्रता आह् ली झिल्ली (कम कीते गेदे अंतर स्पेक्ट्रम गी घट्ट करियै आक्सीजन कन्नै निर्धारत कीता गेआ ऐ ते दागदार जेल पर लोड गी मिलान करियै) दो बारी पतला कीता गेआ। प्रोटीन गी प्रतिकृति 12% बिस्-ट्रिस नुपेज जेल (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) पर बक्ख कीता गेआ। आरसी-एल सब-यूनिट गी लोड ते विज़ुअलाइज़ करने आस्तै इक जेल गी कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (बायो-रैड, यूके) कन्नै रंगेआ गेआ। दूई जेल पर प्रोटीन गी इम्यूनोएसे आस्तै मेथानॉल-सक्रिय पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) च स्थानांतरित कीता गेआ। पीवीडीएफ झिल्ली गी 50 मिमी ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.6), 150 मिमी NaCl, 0.2% (v / v) ट्वीन-20 ते 5% (w / v) स्किम कीते गेदे दुद्ध पाउडर च ब्लॉक कीता गेआ हा, ते फिर एंटी-हिस प्राथमिक एंटीबॉडी (इंटीबॉडी बफर गी पतला करो [50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.6) च) कन्नै इन्क्यूब कीता गेआ हा, जिस च एंटीबॉडी बफर गी पतला करो [50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.6) च। 150 मिमी NaCl ते 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, बेथाइल लैबोरेटरीज, यूएसए) च 4 घैंटें तगर। एंटीबॉडी बफर च 5 मिनट तगर 3 बारी धोने दे बाद, झिल्ली गी हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (सिग्मा-एल्ड्रिच, यूके) एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (एंटीबॉडी बफर च 1:10,000 पतला) कन्नै जोड़ेआ गेआ तां जे पता लाने दी अनुमति दित्ती जा (एंटीबॉडी बफर च 3 मिंटें दे बाद) WESTAR ETA C 2.0 केमिलुमाइनस्केंस सब्सट्रेट दा इस्तेमाल करियै (सियानाजेन, इटली) ते अमेरशम इमेजर 600 (जीई हेल्थकेयर, यूके)।
हर इक दागदार जेल जां इम्यूनोएसे लेन दे तीव्रता वितरण गी खींचने कन्नै, चोटी दे हेठले क्षेत्र गी इकट्ठा करियै ते आरसी-एल (दागदार जेल) ते प्रोटीन-डब्ल्यू (इम्यूनोएसे) दे तीव्रता अनुपात दी गणना करियै, इमेज जे (57) च छवि गी संसाधित करो। इनें अनुपातें गी इस गल्लै गी मनदे होई जे शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू नमूने च आरसी-एल ते प्रोटीन-डब्ल्यू दा अनुपात 1:1 ऐ ते इसदे मुताबिक पूरे डेटा सेट गी सामान्य करियै मोलर अनुपात च बदलेआ गेआ।
इस लेख आस्तै पूरक सामग्री आस्तै कृपा करियै दिक्खो http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
एह् इक खुल्लै पहुँच आलेख ऐ जेह् ड़ा क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन लाइसेंस दी शर्तें दे तैह् त बंड्डेआ गेदा ऐ। लेख इस शर्त पर किसे बी माध्यम च अप्रतिबंधित इस्तेमाल, वितरण ते प्रजनन दी अनुमति दिंदा ऐ जे मूल रचना दा ठीक ढंगै कन्नै हवाला दित्ता जा।
नोट: अस तुसेंगी सिर्फ अपना ईमेल पता देने लेई आखने आं तां जे जिस माह् नू गी तुस पेज पर सिफारिश करदे ओ ओह् जानन जे तुस चाह्न्दे ओ जे ओह् ईमेल दिक्खन ते एह् स्पैम नेईं ऐ। अस कुसै बी ईमेल पते गी कैप्चर नेईं करगे।
इस सवाल दा इस्तेमाल इस गल्लै गी परखने लेई कीता जंदा ऐ जे तुस विजिटर ओ जां नेईं ते स्वचालित स्पैम जमा करने गी रोकने लेई कीता जंदा ऐ।
डेविड जे के स्वैन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम Faries, डारियस एम Niedzwiedzki, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, लोर्ना ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए रैंसन, डैनियल पी कैनिफ , मार्क जे डिकमैन, डेवी होल्टेन, क्रिस्टीन किरमैयर, एंड्रयू हिचकॉक, सी नील हंटर
रिएक्शन सेंटर च लाइट ट्रैप 1 परिसर दी उच्च रिजोल्यूशन संरचना क्विनोन गतिशीलता च नमीं जानकारी दिंदी ऐ।
डेविड जे के स्वैन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम Faries, डारियस एम Niedzwiedzki, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, लोर्ना ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए रैंसन, डैनियल पी कैनिफ , मार्क जे डिकमैन, डेवी होल्टेन, क्रिस्टीन किरमैयर, एंड्रयू हिचकॉक, सी नील हंटर
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